Conformations fonctionnelles du transporteur de protéines FhaC: ouverture latérale d'un tonneau beta dans une membrane biologique – OPEN_BAR

La voie de sécrétion à deux partenaires est dédiée à l’export de protéines, dont certains facteurs de virulence, à travers la membrane externe de bactéries Gram-négatives. Les protéines TpsB à tonneau ß transmembranaire assurent la sécrétion de leurs protéines substrats à travers cette membrane. Elles font partie, tout comme les transporteurs BamA, de la superfamille Omp85, dédiée au transport ou à l’insertion de protéines dans la membrane externe bactérienne ou dans des membranes spécifiques d’organelles eucaryotes. Notre objet d’études est FhaC, le transporteur TpsB de l’adhésine FHA chez Bordetella pertussis et un paradigme reconnu de transporteur Omp85. Ces transporteurs exercent leurs fonctions sans ATP ou gradient electrochimique. D’un point de vue fondamental, leur mode d’action fait l’objet d’un vif intérêt. D’un point de vue appliqué, les transporteurs Omp85 bactériens sont des cibles potentielles d’antibiothérapie innovante.

Les protéines Omp85 sont composées de domaines POTRA intracellulaires, suivis d’un tonneau ß transmembranaire, qui chez FhaC sert de canal pour le transport de la FHA. Les domaines POTRA sont impliqués dans des interactions protéine- protéine, et notamment dans la reconnaissance du substrat dans le périplasme. Une caractéristique de la famille est une boucle extracellulaire conservée, L6, dont l'extrémité est en interaction avec un motif conservé de la paroi interne du tonneau. Chez FhaC, il y a aussi une hélice alpha N-terminale, H1, qui traverse le pore. H1 et L6 stabilisent la forme fermée du transporteur au repos dont la structure cristallographique est connue. Les mécanismes moléculaires de l’activité de transport de FhaC restent incompris et font l’objet de ce programme. FhaC est très dynamique, et le mouvement de sortie de H1 du tonneau serait la première étape des changements de conformation liés à son activité de transport. Notre hypothèse est que la sécrétion implique un mécanisme cyclique d’élargissement du tonneau. L’entrée de la FHA dans le pore et sa progression vers la surface cellulaire seraient liées à des changements réversibles de la conformation de FhaC, avec une ouverture latérale du tonneau et l’insertion d’une portion amphipathique du domaine POTRA2 dans cette ouverture. Ce mouvement entrainerait la région de FHA liée au domaine POTRA2 vers le pore. Le substrat serait ensuite libéré vers la surface, et les domaines POTRA reprendraient leur position périplasmique pour un nouveau cycle. Les changements de conformation de L6 stabiliseraient les formes alternatives de FhaC et/ou empêcheraient le retour en arrière du substrat dans le canal.

Ce cycle implique des conformations alternatives et transitoires de FhaC, que nous explorerons par des approches capables de détecter des conformations minoritaires dans une population hétérogène et de suivre la dynamique d’une protéine à différents niveaux de résolution. Nous combinerons la spectrométrie de masse native couplée à la mobilité ionique, la spectrométrie de masse avec échange hydrogène-deutérium et la résonnance magnétique nucléaire dans les états solide et en solution pour caractériser FhaC sauvage en détergent et dans un environnement lipidique. Nous le comparerons avec un petit nombre de variants obtenus par mutagenèse ciblée, bloqués dans la conformation fermée ou à l’inverse pour lesquels l’équilibre des conformations est déplacé vers la forme ouverte, et qui seront analysés par les mêmes approches. Nous déterminerons le profil d’énergie et la cinétique des changements de conformation qui se produisent au cours du cycle de sécrétion. Nous essayerons d’obtenir par cristallographie aux rayons X la structure d’un variant plus ouvert, avec l’aide de nanobodies. Ces approches complémentaires nous permettront de proposer un modèle d’action de FhaC et de décrire ainsi un nouveau paradigme fonctionnel pour le transport de protéines à travers une membrane biologique.