Une approche multidisciplinaire et intégrative pour comprendre l'assemblage, la structure et la dynamique d'une plateforme de queue contractile – T6-PLATFORM

Phages et bactéries ont développé des machineries contractiles permettant d'injecter des acides nucléiques ou des protéines dans des cellules cibles. Tandis que les bactériophages délivrent des acides nucléiques pour se multiplier, le système de sécrétion de Type VI (SST6) permet de transporter des effecteurs protéiques. Le SST6 est capable de cibler des cellules eucaryotes et d'autres bactéries, et ainsi participe à la virulence bactérienne à la fois de manière directe mais également de manière indirecte en tuant des bactéries compétitrices pour mieux coloniser une niche. D'un point de vue moléculaire, le SST6 peut-être comparé à un harpon: il est composé d'une tube interne rigide entouré d'un fourreau contractile. Ce fourreau est assemblé sour une conformation étendue, énergétiquement défavorable. La contraction du fourreau permet alors de propulser le tube interne vers la cellule cible. Cette structure contractile, appelée "queue", s'assemble sur une plateforme. Cette plateforme n'est pas seulement responsable de l'assemblage de la queue contractile, mais également ancre la queue à l'enveloppe membranaire en établissant des contacts étroits avec le complexe membranaire. La plateforme est également responsable des changements de conformation qui conduisent à la contraction du fourreau et du recrutement de certaines toxines. Malgré des avancées majeures pour la compréhension de l'assemblage et du mode d'action du SST6, et le rôle important de la plateforme, peu d'informations sont disponibles sur cette structure. Le projet que nous souhaitons développer vise à mieux comprendre l'assemblage de la plateforme, son architecture, son interaction avec le complexe membranaire et les changements de conformations qui ont lieu lors de son assemblage. Nous avons récemment identifié les sous-unités qui la constituent: VgrG, TssE, TssF, TssG et TssK. De plus, nous avons montré que la protéine TssA est recrutée au complexe membranaire et permet le recrutement et la stabilisation de la plateforme, avant de coordonner l'extension du tube et du fourreau contractile. Dans ce projet, nous déterminerons comment les différentes protéines qui constituent la plateforme s'assemblent. Nous purifierons la plateforme ainsi que les complexes intermédiaires afin de les caractériser par une combinaison d'approches: (i) microscopie électronique et cryo-microscopy électronique afin d'obtenir des informations structurales , (ii) spectrometrie de masse native et gel filtration afin de déterminer la composition et le stoechiométrie dans les complexes intermédiaires, (iii) pontage covalent couplé à des analyses de spectrométrie de masse, suivi d'une validation par mutagénèse dirigée afin de déterminer les sites de contact entre les sous-unités de la plateforme, ainsi qu'entre la plateforme et le complexe membranaire, (iv) tests fonctionnels afin de déterminer l'importance de ces interactions pour le fonctionnement du SST6, (v) cryo-tomographie afin de visualiser la plateforme sous son état natif, dans les cellules. Enfin, l'ensemble des données générées lors de ce travail seront utilisées pour des simulations de manière à générer des modèles sur l'assemblage et le mécanisme d'action du SST6. Enfin, nous souhaitons développer une approche novatrice permettant de pouvoir suivre in situ les contacts qui s'établissent entre les différentes sous-unités. Ce projet nécessite l'utilisation de nombreuses techniques émergentes: microscopie électronique, cryo-microscopie et cryo-tomographie, spectrométrie de masse native couplés à des analyses d'interaction protéine-protéines et des analyses in vivo. Nous avons donc constitué un consortium regroupant quatre équipes reconnues internationallement pour l'étude de ce système ou pour le développement de ces techniques. L'ensemble des ces données permettra de mieux comprendre l'assemblage et le mode d'action des machineries contractiles.