Systèmes d’efflux minimaux pour l’étude fonctionnelle des complexes tripartites de la paroi bactérienne – MISTEC

Des décennies de surutilisation des antibiotiques pour lutter contre les infections bactériennes ont entraîné une augmentation dangereuse des souches pathogènes résistantes à la plupart des antibiotiques disponibles. Face à l’absence de développement de nouvelles molécules, la résistance aux antibiotiques devient donc un problème de santé publique dans le monde entier. Il est alors urgent de développer des solutions originales qui se focalisent sur des cibles non conventionnelles. L'efflux actif des antibiotiques hors de la cellule est un mécanisme qui permet à la bactérie de tolérer puis de résister aux antibiotiques. En effet pour qu’ils soient efficaces, les antibiotiques doivent atteindre leurs cibles et s'accumuler à des concentrations suffisantes pour agir. Pour la plupart ils diffusent passivement à travers l'enveloppe cellulaire. Lorsqu’ils sont expulsés plus rapidement qu'ils ne peuvent diffuser, les concentrations intrabactériennes sont maintenues faibles et deviennent inefficaces. En développant des molécules dites « adjuvantes » qui n'ont pas d'activité antibiotique par elles-mêmes, mais qui peuvent bloquer les systèmes d’'efflux, il est possible de restaurer l'activité des antibiotiques et ainsi de surmonter la résistance. La mise au point de telles molécules nécessitent une meilleure compréhension des mécanismes d'efflux actifs. Les bactéries Gram négatif exploitent les transporteurs multidrogue pour expulser hors de la cellule des composés toxiques, y compris toutes les familles d'antibiotiques. Parmi ces transporteurs, les complexes d’efflux tripartites (TEC) sont composés de deux protéines membranaires (transporteur et canal externe) localisées dans les deux membranes opposées, et une troisième (adaptateur) périplasmique ancrée dans la membrane interne. En s’assemblant, elles forment un canal hermétique qui permet d’expulser les antibiotiques dans le milieu externe. Chez Pseudomonas aeruginosa qui est la troisième cause d'infection nosocomiale, la résistance à la fluoroquinolone est liée à la surproduction des TEC de la famille RND. Pour développer des molécules adjuvantes contre les RND-TEC, il est nécessaire d’identifier avec précision des cibles potentielles. Pour cela, il est nécessaire par un travail de recherche fondamentale de déchiffrer la séquence d'événements conduisant à l'assemblage des RND-TEC et de caractériser les rôles de l'adaptateur et du conduit externe dans ce processus. Malgré les dernières avancées structurales, la structure de l'assemblage fonctionnel n'est pas encore connue. Ce projet vise non seulement à reconstituer un RND-TEC fonctionnel en liposome permettant de mesurer le transport de drogue, mais aussi à déterminer la structure de cet assemblage fonctionnel en utilisant la cryo microscopie électronique haute résolution combinée à la cristallographie des rayons X. Nous analyserons les RND-TECs responsables de la résistance aux fluoroquinolones (MexA Adaptateur - MexB Transport - OprM Canal) et aux aminoglycosides (MexX / MexY /OprM) pour caractériser les éléments structuraux régissant la reconnaissance spécifique de l'adaptateur (MexX / MexA) avec le conduit externe OprM. Ceci consitue une étape importante dans l'étude du cycle d'efflux des médicaments par les RND-TECs. Parallèlement à ces études structurales, le cycle d'efflux sera reconstitué dans des systèmes membranaires minimaux. Il sera ensuite analysé par des méthodes spectroscopiques de surface et de fluorescence pour décrire les différentes étapes. La réorganisation moléculaire des RND-TEC liée à la dynamique du transport sera analysée à l’aide de mutants cystéines de MexB et OprM. Ces études structurales et fonctionnelles nous éclaireront sur le fonctionnement du cycle d'efflux complet, en particulier sur le processus d'assemblage / désassemblage et l'ouverture du conduit externe. Ces travaux jetteront les bases pour définir les sites cibles nécessaire au développement d’inhibiteurs des systèmes d’efflux.