Etude structurale du mécanisme d'intégration des rétrotransposons de levure dans les gènes transcrits par l'ARN Polymérase III – INstruc

Les rétroéléments se répliquent par transcription inverse de leur génome ARN en un ADN complémentaire qui est intégré de manière stable dans le génome de la cellule hôte par leur intégrase (IN). L'intégration n’est pas aléatoire in vivo. La spécificité d’intégration des rétroéléments dépend principalement de l'interaction de l’IN avec des facteurs cellulaires qui vont diriger l’insertion virale vers des régions préférentielles. Cependant, les bases moléculaires régissant le choix du site d’intégration restent encore mal comprises.
L’étude des rétrotransposons Ty1 et Ty3 de levure a contribué à une meilleure connaissance de la biologie des rétroéléments. Ils s’intègrent au niveau des gènes transcrits par l’ARN Polymérase III (Pol III), qui sont des régions pauvres en gènes. Cette remarquable sélectivité du site d'intégration a été étudiée in vivo et in vitro; Toutefois, il n'existe aucune information structurale sur le processus d'intégration ou d'interaction avec la Pol III.

Ce projet vise à comprendre comment les interactions entre les intégrases de Ty1 et Ty3 et les différents constituants de la machinerie de transcription par la Pol III contribuent à l’intégration ciblée.

Notre stratégie sera d'obtenir et de caractériser les structures des intégrases de Ty1 et Ty3, et également celles des complexes obtenus avec leurs partenaires de la machinerie Pol III, afin de disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans ces interactions.

Nous suivrons le programme suivant :
1) exprimer et analyser les propriétés biophysiques des complexes IN-Pol III
- produire des protéines actives homogènes impliquées dans le processus d'intégration;
- utiliser des techniques biochimiques et biophysiques pour caractériser l'interaction des INs avec l’ADN viral et leurs partenaires Pol III respectifs, et définir les conditions optimales pour assembler et purifier des complexes stables.

2) caractériser au niveau atomique le mécanisme d'intégration de Ty1 et Ty3 et les interactions avec la machinerie Pol III
- cristalliser et caractériser la structure des protéines IN apo et complexées avec l'ADN. Notre objectif est d'isoler, stabiliser et déterminer la structure des intermédiaires d'intégration pour définir le mécanisme d'intégration;
- analyser les complexes IN-Pol III par cryo-EM et les comparer aux modèles atomiques de Pol III libre ou à la structure cristallographique de TFIIIB.

3) construire des IN rétrovirales chimères dotées de la spécificité d’intégration de Ty1
- identifier les acides aminés responsables de l'interaction directe entre l’IN de Ty1 et Pol III;
- analyser in vivo l'impact des mutations qui abolissent ces interactions sur l'intégration ciblée de Ty1;
- étudier si l'interaction Ty1 IN-Pol III est régulée par des modifications post-traductionnelles;
- concevoir des IN rétrovirales chimériques dotées des préférences d'intégration de Ty1 qui pourraient être utilisées dans des vecteurs de transfert de gènes.

Plusieurs résultats sont attendus :
- la première caractérisation structurale de l'interaction entre un complexe multi-protéique et une intégrase de rétroélement, qui devrait permettre d’expliquer comment les interactions IN/Pol III contribuent à la sélection du site d'intégration ;
- une meilleure compréhension des mécanismes régulant la spécificité d'intégration des rétrovirus. Ces résultats auront un impact important sur la santé humaine en fournissant des outils précieux pour la conception de nouvelles molécules modulant l'intégration rétrovirale.
- la possibilité de modifier les préférences d'intégration d'autres rétrovirus. Cette avancée constituerait une contribution majeure au développement d'une nouvelle génération de vecteurs de thérapie génique plus sûrs qui cibleraient préférentiellement des régions non essentielles du génome. Avec ce projet, nous devrions apporter une preuve de concept qu’il est possible de construire de tels vecteurs.