Cristallisation in vivo: une nouvelle stratégie pour étudier la structure et la dynamique des protéines dans les lasers à électrons libres et les synchrotrons. – X-in-vivo

L’avènement des lasers à électrons libres (XFELs) a révolutionné la biologie structurale, autorisant la détermination de structures macromoléculaires à partir de cristaux nanométriques et des études résolues en temps ultracourts (fs-ps). Le projet X-in-vivo vise le développement d’une méthode de nano-cristallisation in vivo, avec en ligne de mire la cristallographie sérielle statique et temps-résolue dans les synchrotrons et les XFELs. De telles tailles de cristaux sont en effet parfaitement adaptées pour des études temps-résolues sur les protéines photo-actives. Nous proposons d’utiliser Bacillus thuringiensis et sa panoplie de protéines Cry/Cyt comme milieu et chaperonnes de cristallisation, respectivement. Sur la durée de ce projet, nous nous focaliserons sur deux protéines photoactives, rsFolder et la protochlorophyllide oxidoreductase (POR), qui diffèrent largement dans leur propension à cristalliser. Nous tenterons d’obtenir des cristaux de ces protéines en isolation ou en fusion avec des protéines Cry/Cyt qui acteront comme des chaperonnes de cristallisation. Nos cristaux seront examinés pour leur fonctionnalité, par spectrophotométrie et microscopie, et pour leur qualité cristalline, par micro-diffraction sérielle au synchrotron à température ambiante et à 100 K. rsFolder est prône à la cristallisation in vitro, et donc un cas favorable pour explorer la faisabilité de la nanocristallisation in vivo, au sein de Bt. Spécifiquement, nous viserons à comprendre comment l’espace de cristallisation en Bt est modulé par ses protéines Cry/Cyt et la propension de chacune à se conduire comme une chaperonne de cristallisation. Nous utiliserons nos nanocristaux de rsFolder formés in vivo, fonctionnels et diffractant à haute résolution, pour réaliser une étude résolue en temps qui révèlera les bases moléculaires du photoswitching au sein de cette protéine. Nous utiliserons ceux de POR à dessein de résoudre la structure statique de cette protéine. En cas de succès, notre méthode se révèlera une méthode de choix pour les chercheurs en quête de large quantité de biomatériaux nanocristallins des études structurales temps-résolues dans les XFELs, ou cherchant à cristalliser de fragiles protéines ou complexes de protéines qui, après extraction du milieu cellulaire, se dégradent et ne cristallisent plus.