Etude cinétique du cycle des pentoses phosphates par méthodes de polarisation nucléaire dynamique avec dissolution (D-DNP) – enzypol

L’étude de la cinétique enzymatique et du métabolisme cellulaire est centrale pour la compréhension de la fonction cellulaire et des maladies métaboliques. Dans les cas d’affections génétiques, la capacité d’adaptation des enzymes cellulaires détermine souvent la sévérité de la maladie. Plus de 500 maladies sont dues à des défauts du métabolisme. L'analyse des voies métaboliques et de leurs rapports représente une approche novatrice pour identifier de nouvelles cibles et molecules thérapeutiques. Un exemple récent impressionnant à cet égard est celui de la sclérose en plaques, dans laquelle l'administration de biotine, cofacteur de plusieurs enzymes clefs, permet une amélioration clinique. Une description détaillée des flux métaboliques dans la cellule est donc de prime importance pour comprendre et suppléer aux erreurs du métabolisme.
Certaines voies métaboliques dans la cellule ont été modélisées numériquement, permettant de prévoir les effets de certaines substances sur la régulation des flux métaboliques. Cependant, très peu de telles prédictions ont été confrontées à des données expérimentales, comme dans le simple cas de la glycolyse.
Nous étudierons en détails la phase oxydative du cycle des pentoses phosphates (CPP). Cette étape comprend une cascade de trois enzymes, la glucose-6-phosphate deshydrogénase (G6PDH), la 6-phosphogluconolactonase (6PGL) et la 6-phosphogluconate deshydrogénase (6PGDH). Cette étape produit le NADPH qui est un puissant anti-oxydant, également impliqué dans la biosynthèse des macromolécules et des acides gras. L’activité du CPP est modulée par de nombreux facteurs et son altération peut gravement affecter le fonctionnement de la cellule. Ces notions justifient pleinement une étude en profondeur des étapes individuelles ainsi qu’une étude globale de sa cinétique et de ses couplages à d’autres voies métaboliques.
Nous étudierons chacune des enzymes de la phase oxydative du CPP, puis celui-ci de manière globale ; in vitro et dans des suspensions de cellules (CHO,... et Trypanosoma brucei, l'agent infectieux de la maladie du sommeil) de façon à se placer dans des conditions "pseudo-physiologiques", où les interactions avec d'autres voies métaboliques sont présentes.
Ces études sont rendues possibles par les techniques de Polarisation Nucléaire Dynamique avec Dissolution (D-DNP) qui permettent des amplifications de signal de résonance magnétique nucléaire inédits de 4-5 ordres de grandeur. Cette augmentation de sensibilité permet de suivre la cinétique enzymatique par RMN avec une résolution temporelle inférieure à la seconde. L'observation du signal RMN par D-DNP des métabolites des enzymes du CPP permettra l'étude de leurs cinétiques individuelles et de la dynamique globale du cycle. Les effets de diverses drogues et inhibiteurs spécifiques seront ainsi repérés et quantifiés.
Nous développerons et utiliserons la D-DNP pour aboutir à l'analyse quantitative de la cinétique enzymatique résolue en temps et accéder aux valeurs des constantes cinétiques, ce qui est impossible par les méthodes usuelles.
La 6PGL de Trypanosoma brucei pourrait représenter une cible thérapeutique dans la maladie du sommeil. Ceci est suggéré par le fait que le CPP est présent non seulement dans le cytosol, mais aussi dans le glycosome, une organelle absente chez l'homme. Ceci pourrait augmenter la sélectivité de la toxicité de drogues envers le parasite. De plus, la toxicité des lactones, normalement évitée par la 6PGL, pourrait potentialiser cet effet. Ces perspectives sont d'autant plus intéressantes que l'arsenal thérapeutique contre T. brucei est limité, peu efficace et très toxique. Certains travaux récents évoquant la 6PDH comme cible potentielle sont une motivation supplémentaire.
Dans cette optique, le premier inhibiteur de la 6PGL, synthétisé par le partenaire 3 sera également étudié par D-DNP, seul et en association avec des inhibiteurs du CPP et des molécules trypanocides, sur différentes lignées de T. brucei.