Spécificités structurales et potentiel biotechnologique de la PolD, une ADN polymérase atypique d'archée – ARCHAPOL

Les ADN polymérases (ADNPs) sont des nano-machines capables de synthétiser de l’ADN à partir de nucléotides. Les analyses des séquences et des structures des ADNPs ont permis de les regrouper en sept familles : A, B, C, D, X, Y et la transcriptase-inverse. Au-delà de leurs fonctions biologiques essentielles, les ADNPs sont des outils précieux nécessaires à de nombreuses applications en biologie moléculaire. Parmi ces applications, la plus connue est la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Dans une réaction de PCR, l’ADN est amplifié par des ADN polymérases thermostables, qui se distinguent par leurs propriétés enzymatiques, telles que la spécificité, la fidélité, la résistance à divers contaminants, … La PCR, qui a participé à révolutionner la biologie moléculaire, est désormais largement utilisée en médecine clinique et en médecine légale. Cependant, le développement de la PCR en médecine clinique et médecine légale représente un défi supplémentaire, car il requiert des ADNPs capables d’amplifier de l’ADN à partir de tissus biologiques, de sang, et d’autres fluides biologiques.

Toutes les ADNPs commercialisées en PCR appartiennent invariablement aux familles A, B et Y. Récemment, la PolD, une nouvelle famille d’ADNPs (la Famille D) a été découverte chez des archées thermophiles. La PolD possède des propriétés biochimiques intéressantes, exploitables en PCR. En particulier, il a été montré que la PolD de Pyrococcus abyssi possède non seulement une thermo-résistance accrue par rapport à la Taq polymérase, mais la PolD est également totalement résistante à l’hémoglobine, et plus résistante envers plusieurs inhibiteurs (sels et détergents). De plus, parmi les enzymes commercialisables en PCR, la PolD possède une des plus fortes tolérances aux ions calcium, suggérant que la PolD est une enzyme parfaitement adaptée pour amplifier de l’ADN à partir d’échantillons humains (os, dents). La PolD est composée d’une grande sous-unité catalytique (DP2) et d’une petite sous-unité qui porte l’activité de relecture exonucléase (DP1). Nous avons déterminé les structures cristallographiques des deux sous-unités isolées de la PolD de P. abyssi. Ces structures ont montré que la PolD se distingue structurellement des autres ADNPs et ont permis de mettre en évidence une parenté évolutive inattendue avec les ARN polymérases à sous-unités multiples qui sont responsables de la transcription dans toutes les formes de vie cellulaires. Toutefois, le site actif de la PolD est localisé à l’interface entre les sous-unités DP1 et DP2, et les structures cristallographiques de ces deux sous-unités isolées ne permettent pas de caractériser les mécanismes moléculaires de liaison à l’ADN, de polymérisation des nucléotides, et de relecture par la PolD. Déterminer les bases moléculaires de la fonction de la PolD est cependant essentiel afin d’exploiter son potentiel biotechnologique.

Nous avons développé une approche structurale multidisciplinaire (microscopie électronique, cristallographie aux rayons-X, SAXS et SANS), afin d’étudier la structure de la PolD native (DP1-DP2) en complexe avec l’ADN. Nous utiliserons différents substrats, permettant de piéger la PolD dans ses modes d’élongation et de relecture, ainsi qu’en complexe avec le PCNA, un acteur clé de la fourche de réplication, qui stimule considérablement la processivité de la PolD. Ces données structurales nous permettrons, par des approches d’ingénierie des protéines et d’évolution dirigée, de concevoir des variants de la PolD qui combineront les propriétés naturelles de la PolD (thermostabilité, spécificité, processivité, résistance à de nombreux inhibiteurs) avec de nouvelles propriétés, dont une résistance accrue à l’héparine (un anti-coagulant, inhibiteur de PCR, présent dans de nombreux échantillons biologiques) et un couplage optimal au PCNA. Ces variants de la PolD présenteront un grand potentiel biotechnologique pour de nombreuses applications PCR en médecine clinique et légale.