Suivi intracellulaire de la fonction d'une protéine par la conception et la synthèse de sondes fluorogéniques pour l'imagerie de type MEMORY – GLUTTRACK

Ce projet concerne le défi de suivre le parcours d’une protéine particulière dans la cellule eucaryote, son installation dans des organelles, et/ou sa migration vers la membrane cellulaire. Pour ceci nous souhaitons mettre en valeur une des trois ou quatre stratégies aujourd’hui considérées pour cette tache: l’incubation de la cellule génétiquement transformée avec une sonde moléculaire exogène et furtive qui, après interaction avec la protéine à la surface de la cellule ou après pénétration dans le cytoplasme, subit une transformation chimique qui a pour conséquence le relargage d’une molécule hautement insoluble. Cette molécule, en l’occurrence “l’alcool ELF97” ou ses dérivés, précipite rapidement et émet une intense fluorescence qu’une fois atteint l’état solide. Par rapport aux autres stratégies qui doivent tous assurer la rétention du signal au lieu de résidence de la protéine d’intérêt, celle-ci se distingue par le phénomène de l’amplification du signal, c’est-à-dire la correspondance d’un nombre potentiellement très élevé de molécules signalisantes générées par une seule molécule biologique cible. Une grande sensibilité de détection peut ainsi être atteinte. Une telle amplification est assurée par l’action d’un bio-catalyseur, une enzyme, et la sonde moléculaire doit donc forcément fonctionner comme un substrat (artificel) pour cette enzyme. Le choix de l’enzyme par le chercheur doit être fait parmi celles qui ne sont pas présent dans la cellule hôte d’étude (autre que conjugé avec la protéine d’intérêt), mais pour lesquelles le chimiste peut proposer une sonde de type substrat artificiel qui relarge un signal physique répérable. Une fois ce choix fait (en l’occurrence la penicillin amidase, la beta-lactamase, et la beta-galactosidase), il faut apprendre à la cellule hôte de produire (exprimer) un conjugé (une protéine de fusion) entre la protéine d’intérêt, de laquelle on souhaite connaitre ses lieux de résidence, et l’enzyme choisie. Cette apprentissage se fait par l’utilisation de protocoles expérimentales appartenant à une discipline voisine de la chimie, la biologie moléculaire. Le projet proposé est donc resolument inter-disciplinaire. Une lignée cellulaire hôte est ainsi génétiquement transformée et exprime désormais la protéine d’intérêt sous forme d’un conjugé avec l’enzyme. Ce projet ciblera une protéine particulière comme modèle, le transporteur de glucose 4 (GLUT4). Dans un 2ème temps, nous envisageons de tester également le comportement migratoire du Toll-like receptor 4 (TLR4). Le partenaire japonais a une bonne expérience d’étude cellulaire de ces deux protéines, et il maitrise bien leur conjugaison avec d’autres protéines. Il a introduit le nouveau concept d’imagerie MEMORY afin de le distinguer du résultat d’un seul point temporel qui peut être obtenu par des méthodes histochimiques classiques. Le partenaire français est l’originaire d’une gamme originale de sondes fluorogènes (furtives) qui relargent le précipité ELF97. Il est le seul à proposer de telles sondes pour une gamme étendue d’enzymes. La complémentarité et le potentiel de synergie est donc forte.