Plasticité du Pore Nucléaire – NPC-PLASTIC

Ce projet est réalisé dans la levure, un organisme simple mais dans lequel les fonctions fondamentales, dont celles du NPC, sont conservées et qui est aisément manipulable génétiquement, et sans risque. Nous utilisons des approches expérimentales combinant donc la génétique, la biochimie (ou chimie du vivant), la biologie moléculaire ainsi que des approches de microscopie qui nous permettent de suivre les molécules dans les cellules vivantes. Ce projet interdisciplinaire propose également d’utiliser des méthodes de microscopie à haute résolution associées à des approches innovantes de traitement d’images.

Nos récentes études suggéraient que l’ubiquitylation et d’autres modifications chimiques similaires jouent un rôle important dans la modulation des fonctions du pore nucléaire. L’ubiquitine est une petite molécule qui, en se fixant spécifiquement sur des protéines cibles dicte les fonctions de ces protéines. Dans ce projet, nous avons décrypté ces modifications chimiques sur la face nucléaire du NPC, leur dynamique lors de la division cellulaire et avons pu mettre en évidence leur rôle dans la dynamique d’association avec le cœur du pore avec des conséquences sur le maintien de l’intégrité du génome, mais aussi comme senseurs des stress environnementaux auxquels est confrontée la cellule.

Les résultats obtenus ouvrent des perspectives importantes quant au role des modifications posttraductionnelles sur la dynamique et les fonctions du pore nucléaire, qui sont maintenant les cibles de nouvelle drogues thérapeutiques.

Ce projet a mené à 4 publications dont 3 impliquant les 2 partenaires, dans des journaux internationaux, à comité de lecture, réputés dans leur domaine. Le projet a permis également le développement d’un logiciel de localisation 3D, mis à disposition sous forme d’un Plug-In sur FIJI/ Image J et un transfert de technologie du systeme «Live-SR« à la société GATACA.

Le Complexe de Pore Nucléaire (NPC) constitue l'unique structure à travers laquelle s'effectuent les échanges moléculaires massifs et sélectifs entre le noyau et le cytoplasme. Le NPC, un gigantesque complexe de l'enveloppe nucléaire, est une plaque tournante coordonnant le transport nucléocytoplasmique, l’expression des gènes, l’organisation de la chromatine et l’intégrité du génome. Cependant, le nombre limité de NPC impose une hiérarchisation de ces fonctions dans le temps et l'espace. Comprendre au niveau moléculaire, comment le NPC intègre ces contraintes fonctionnelles représente le prochain défi de la connaissance de cette machine cellulaire fascinante.

De nombreuses études ont permis d'élucider l'architecture moléculaire et la composition protéique du NPC ainsi que sa conservation au cours de l'évolution. Cependant les associations dynamiques de nucléoporines (Nups), leurs modifications post-traductionnelles ou conformationnelles ou les changements temporels de leur expression représentent des niveaux supplémentaires de complexité encore peu explorés. Une analyse systématique des modifications du NPC par l'ubiquitine que nous avons réalisée nous permet de proposer l'hypothèse selon laquelle les modifications post-traductionnelles (PTM), et en particulier l'ubiquitylation et la sumoylation, contrôleraient la plasticité architecturale du NPC et son rôle de plateforme orchestrant l'expression de gènes.

Dans ce projet, nous proposons de nous focaliser sur la face nucléaire du NPC-dite panier de basket- et de disséquer précisément comment le jeu de rôles des PTM contrôle structure, composition et dynamique du NPC au cours du cycle cellulaire ainsi que ses diverses fonctions de régulation de l'expression des gènes. Nous concentrerons nos efforts sur trois objectifs majeurs. Tout d'abord, nous réaliserons une analyse précise des PTM des Nups composant le panier de basket, leurs interconnections et leurs rôles dans le contrôle de la dynamique du NPC. Cette étude nous permettra de disséquer les mécanismes responsables de la plasticité architecturale du NPC. Notre second objectif consiste à déterminer la fonction de ces PTM lors du cycle cellulaire et de la transmission des NPCs à la cellule fille. Pour analyser la dynamique des Nups avec une résolution suffisante, nous utiliserons des méthodes d'imagerie et d'analyse d'image que nous avons récemment validées et qui permettent une précision de localisation avec des échelles de temps appropriées à l'étude en cellule vivante. Le troisième volet de notre projet est de comprendre comment ces PTMs participent à la régulation de l'expression des gènes via le contrôle de la localisation des gènes et leur transcription mais aussi de la cascade d'évènements menant les ARNm de leur site de transcription au NPC. Nous combinerons approches génomiques avec nos récents développements technologiques qui permettent une imagerie fonctionnelle de la biogénèse des ARNm à haute résolution spatiotemporelle dans des cellules vivantes au niveau de cellules uniques.

Approcher la complexité de la plasticité du NPC dans le temps et l'espace requiert une combinaison d'approches expérimentales permettant une dissection des évènements moléculaires au niveau de la cellule et du NPC. Le modèle levure offre l'avantage d'une manipulation génétique aisée, d'un strict contrôle de l'activité transcriptionnelle et une bonne connaissance biochimique des machineries de modifications post-traductionnelles. Ce projet interdisciplinaire propose de combiner ingénierie génétique et analyse biochimique (Partenaire 1) avec l'utilisation de microscopies innovantes et associées à des approches informatiques de traitement d'images (Partenaire 2). Les partenaires possèdent des expertises complémentaires, ont déjà utilisé et développé des combinaisons d'approches multi-échelle et obtenu des résultats préliminaires qui valident et garantissent le succès de ce projet.