Etude des modifications post-traductionelles de facteurs du RNA silencing chez les plantes – REGtheREG

Ce programme de recherche repose en premier lieu sur une analyse par spectrométrie de masse des modifications post-traductionnelles présentes sur les protéines d'intérêts immunoprécipitées. Afin d'éviter l'utilisation de plantes transgéniques exprimant des versions étiquettes de ces protéines, ces immunoprécipitations sont réalisées à l'aide d'anticorps spécifiquement dirigés contre les formes natives des quatre AGOs de la plante modèle Arabidopsis thaliana que nous avons choisi d'étudier.
Une mutagenèse dirigée des résidus identifiés comme étant modifié post-traductionnellement sur ces AGOs sera entrepris afin de déterminer l'impact de l'absence de ces modifications sur différents aspects régulés par l'une ou l'autre de ces AGOs.
L'analyse de mutant T-DNA KO dans des enzymes pouvant être responsable de ces modifications sera également entrepris.
Pour les enzymes préalablement identifiées comme ayant un impact sur un aspect spécifique du RNA silencing, un screen double-hybride, ou des immunoprécipitations couplées à une analyse par spectrométrie de masse, utilisant ces enzymes comme apât sera entrepris afin d'identifier leur cible directe ou indirecte.
Pour les enzymes impliquées dans la phosphorylation ou dephosphorylation de leur cible, une analyse phospho-protéomique des plantes mutantes correspondantes sera également réalisée.

Nous avons achevé la caractérisation détaillé d'une kinase spécifique, identifiée au préalable au laboratoire au cours d'une screen génétique, impliquée dans le RNA silencing post-transcriptionnelle non-cellule autonome. Nous avons déterminé que cette kinase n'était pas impliqué dans la modifications post-traductionnelle des protéines AGOs spécifique du PTGS. Cependant, en utilisant une combinaison d'approches génétique, de biologie cellulaire et de complémentation cellule-spécifique, nous avons pu démontrer que cette kinase régulait spécifiquement le mouvement des siRNA des cellules-compagnes du phloème vers les cellules adjacentes, probablement en régulant le degré d'ouverture des plasmodesmes.

Au cours de nos diverses analyses par spectrométrie de masse, nous avons aussi identifié une nouvelle protéine de fixation à 'ARN double-brin. L'étude de cette protéine a permis de mettre en évidence son rôle dans la production d'une classe spécifique de petits ARNs en séquestrant leur ARN précurseurs.

Par ailleurs, un certain nombre de PTMs a été identifié de manière robuste sur plusieurs des AGOs étudiées. L'impact de ces modifications sur la stabilité ou l'activité des AGOs concernés est en cours.

Enfin, nous avons potentiellement identifié les causes moléculaires de l'altération de la stabilité d'AGO1 observée chez certains de nos mutants. Plusieurs expériences sont actuellement en cours afin de confirmer nos résultats.

Ce projet devrait nous fournir de nouvelles informations importantes concernant notre compréhension des mécanismes du RNA silencing transcriptionnelles et post-transcriptionnelles, leur régulation chez les plantes (et, de part la conservation de ce mécanisme, potentiellement chez les animaux), et leur rôle biologiques au cours des interactions plantes-pathogènes.

Aucun pour le moment

Les organismes vivants doivent constamment équilibrer l’utilisation qu’ils font de leurs ressources entre la croissance et le développement d’une part et la protection face à des stress biotiques ou abiotiques d’autre part. Chez les eucaryotes en général, et chez les plantes en particulier, le RNA silencing joue un rôle prépondérant dans cette balance en liant de manière dynamique les programmes développementaux et les réponses à l’environnement à des modifications de l’expression des gènes. Le terme RNA silencing englobe, de manière générale, l’ensemble des mécanismes conduisant à la suppression de l’expression de gènes, au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel, via des interactions séquence-spécifiques assurées par de petites molécules d’ARN. Ces mécanismes jouent un rôle essentiel dans un grand nombre de processus biologiques tels que le maintien de la stabilité des génomes, le contrôle de l’expression de gènes au cours du développement ou la défense antivirale.
Bien qu’au cours de la dernière décennie un grand nombre de facteurs du RNA silencing ait été identifié chez de nombreuses espèces eucaryotes, conduisant à notre compréhension actuelle de ce processus conservé, il existe très peu d’informations concernant leurs modifications post-traductionnelles. Cependant, il est bien établi que de telles modifications fonctionnent de manière similaire à des commutateurs moléculaires capables de réguler la stabilité ou l’activité des protéines ciblées. Développer ce genre de mécanismes de régulation, permettant le contrôle efficace et potentiellement réversible des différentes voies du RNA silencing, est probablement d’autant plus important chez les plantes, de par leur mode de vie sessile. Dans ce projet, nous nous proposons donc d’identifier les diverses modifications post-traductionnelles de facteurs clés du RNA silencing chez les plantes, de caractériser leur(s) fonction(s) biologiques et de déterminer leur effet ou leur impact en réponse à différents types de signaux environnementaux, en utilisant une combinaison d’approches biochimiques, génétiques et protéomiques de pointe. Les résultats obtenus devraient fournir d’importantes nouvelles avancées dans notre compréhension du RNA silencing, de sa régulation chez les plantes et de son rôle biologique en réponse à des stress biotiques ou abiotiques. De plus, ces résultats pourraient renfermer un intérêt biotechnologique en nous permettant d’entrevoir de nouveaux moyens de réguler les différentes voies du RNA silencing.