Rôle des protéines de l’endocytose dans la mécano-transduction des cellules musculaires – EndoMechano

Le projet EndoMechano s’est appuyé sur une combinaison originale d’approches de biologie cellulaire, de génétique et d’imagerie à haute résolution, permettant d’étudier les plaques de clathrine depuis leur organisation nanométrique jusqu’à leur dynamique dans le muscle vivant.

Un enjeu méthodologique majeur était de visualiser directement les plaques de clathrine et leurs interactions avec le cytosquelette. Grâce au financement ANR, nous avons développé pour la première fois en France une approche de microscopie électronique sur répliques de métal de cellules décapées, permettant d’exposer la face cytoplasmique de la membrane plasmique. Cette technique offre une visualisation en trois dimensions et à très haute résolution des plaques de clathrine, des réseaux d’actine qui les entourent et des filaments intermédiaires qui leur sont associés.

Cette approche ultrastructurale a été combinée à la microscopie de fluorescence et à la super-résolution, ainsi qu’à des marquages immunologiques, notamment à l’or colloïdal, afin d’identifier précisément les protéines présentes au niveau des plaques et du cytosquelette associé. Ces analyses ont permis de localiser des composants du réseau d’actine branchée, la desmine ainsi que les mécanosenseurs YAP et TAZ.

La fonction de ces structures a été étudiée par des perturbations génétiques, notamment par ARN interférents ciblant la clathrine, DNM2 ou des régulateurs du cytosquelette. Des expériences d’étirement cyclique de cellules musculaires cultivées sur des supports flexibles ont permis d’analyser la réponse des plaques aux contraintes mécaniques, leur remodelage par endocytose et la translocation nucléaire de YAP/TAZ.

Enfin, les observations cellulaires ont été confrontées à des modèles physiopathologiques pertinents : cellules musculaires de patients atteints de myopathie centronucléaire et souris knock-in Dnm2-R465W. Une approche d’imagerie intravitale biphotonique, associée à l’expression d’AP2-mCherry et à des expériences de photoblanchiment (FRAP), a permis de suivre directement la distribution et la dynamique des plaques de clathrine dans le muscle vivant et d’évaluer leur altération par les mutations de DNM2.

Le projet EndoMechano a permis d’établir un nouveau rôle de la machinerie d’endocytose dans la mécanotransduction musculaire, en identifiant les plaques de clathrine et la dynamine 2 (DNM2) comme des plateformes organisant le cytosquelette et la réponse aux contraintes mécaniques.

Nous avons tout d’abord montré que les plaques de clathrine sont entourées d’un réseau atypique d’actine branchée, organisé notamment par Arp2/3, N-WASP et DNM2. Ce réseau forme une interface avec les filaments intermédiaires de desmine. La déplétion de la clathrine, d’AP2, de N-WASP ou de DNM2 désorganise cette architecture et entraîne notamment une agrégation de la desmine. Ces résultats démontrent que les plaques ne sont pas de simples structures d’endocytose mais constituent de véritables plateformes d’organisation du cytosquelette musculaire.

Nous avons ensuite démontré leur caractère mécanosensible. L’étirement cyclique des cellules musculaires provoque une diminution de la taille des plaques associée à une augmentation de l’endocytose. Surtout, nous avons identifié les facteurs de mécanotransduction YAP et TAZ au niveau du réseau d’actine entourant les plaques. L’étirement entraîne leur translocation vers le noyau et l’activation de leurs gènes cibles. La déplétion de la clathrine ou de DNM2 perturbe profondément cette réponse, établissant un lien direct entre plaques de clathrine, cytosquelette, endocytose et signalisation YAP/TAZ.

La pertinence physiopathologique de ce mécanisme a été démontrée dans la myopathie centronucléaire liée à DNM2. Dans les muscles de souris knock-in Dnm2-R465W, les plaques de clathrine sont désorganisées et présentent une dynamique anormale in vivo. Des altérations similaires de la signalisation YAP/TAZ ont été observées dans des cellules musculaires de patients, tandis que les biopsies révèlent une accumulation caractéristique de desmine.

Enfin, la technologie développée au cours du projet a permis une découverte dépassant le cadre initial : dans des cellules cancéreuses migrant en trois dimensions, la clathrine forme des structures tubulaires qui entourent et pincent les fibres de collagène, favorisant l’adhésion et la migration cellulaire.

Ces travaux ont ainsi établi un nouveau paradigme reliant endocytose, architecture du cytosquelette et mécanotransduction, avec des implications pour la physiologie musculaire, les myopathies et, plus largement, l’adhésion et la migration cellulaires.

Les résultats d’EndoMechano ouvrent plusieurs perspectives en biologie musculaire, mécanotransduction et physiopathologie. En établissant que les plaques de clathrine constituent des plateformes mécanosensibles associant DNM2, actine branchée, filaments intermédiaires et YAP/TAZ, le projet révèle une fonction de la machinerie d’endocytose qui dépasse largement son rôle classique dans l’internalisation des récepteurs.

Une première perspective consiste à approfondir les mécanismes moléculaires permettant aux plaques de clathrine de détecter les contraintes mécaniques et de les convertir en signaux intracellulaires. Il sera notamment important de déterminer comment DNM2 et les régulateurs de l’actine contrôlent le remodelage des plaques et comment ces modifications sont couplées à la localisation et à l’activité transcriptionnelle de YAP/TAZ. Les résultats obtenus placent DNM2 au centre de cette interface entre membrane, cytosquelette et mécanotransduction.

Une deuxième perspective concerne la physiopathologie des myopathies centronucléaires. Les anomalies des plaques, de la desmine et de la signalisation YAP/TAZ observées dans les modèles portant des mutations de DNM2 suggèrent que l’altération de la mécanotransduction participe directement au mécanisme pathologique. Ces résultats ouvrent la possibilité d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à restaurer l’organisation du cytosquelette ou à moduler les voies YAP/TAZ. Le rapport envisage notamment l’utilisation d’approches pharmacologiques ciblant l’expression ou la localisation de YAP/TAZ.

Au-delà du muscle, ces travaux invitent à rechercher des fonctions similaires des plaques de clathrine dans d’autres cellules soumises à des contraintes mécaniques. La découverte de structures tubulaires de clathrine participant à l’adhésion de cellules cancéreuses aux fibres de collagène illustre déjà la portée générale de ce concept et ouvre des perspectives dans l’étude de la migration tumorale.

Enfin, la technique de microscopie électronique développée dans le cadre d’EndoMechano constitue elle-même une retombée durable du projet. Sa capacité unique à visualiser directement les interactions entre membranes et cytosquelette à l’échelle nanométrique ouvre la voie à de nouvelles collaborations et applications, dans le muscle comme dans d’autres systèmes cellulaires.

La forme autosomale dominante de la myopathie centronucléaire (CNM) est due à des mutations dans le gène de la dynamine 2 (DNM2). La DNM2 et la chaîne lourde de la clathrine (CHC) sont bien caractérisées pour leur rôle dans le trafic intracellulaire et l’endocytose à partir de la membrane plasmique (MP). Nous avons récemment démontré que dans le muscle squelettique, elles régulent la formation et le maintien de larges plaques de clathrine localisées au niveau des sites de fixation entre les sarcomères et la membrane plasmique également connus sous le nom de « costamères ». Ces plaques sont indispensables à l’organisation du cytosquelette d’actine au niveau des costamères et par conséquent, indispensables à la formation des sarcomères. La déplétion in vitro et in vivo de CHC perturbe très fortement l’échafaudage d’actine, la formation et le maintien des costamères et la capacité du tissu musculaire à générer de la force mécanique.
Ce projet vise à comprendre le mécanisme de formation et de régulation de l’assemblage des plaques de clathrine au niveau des costamères et à montrer qu’à travers leurs interactions avec les protéines de liaison à l'actine comme Hip1, Hip1R, et la cortactine, CHC et DNM2 intègrent les forces mécaniques et ajustent en conséquence le cytosquelette d’actine permettant ainsi l'assemblage et le maintien des sarcomères. Nous utiliserons à la fois des approches in vitro et in vivo couplées à de la microscopie à haute résolution afin d'analyser la contribution de protéines de liaison à l’actine dans la formation des costamères. Nous testerons la possibilité que la phosphorylation de CHC et DNM2 par les kinases Src et FAK soient les commutateurs moléculaires qui induisent l'assemblage de plaques de clathrine à la membrane, et nous analyserons l’effet de l’étirement et des contractions sur l’abondance de ces plaques. Notre équipe ayant identifié des mutations de DNM2 comme la cause de la myopathie centronucléaire autosomique dominante, nous porterons un intérêt particulier au rôle physiologique de la dynamine dans ce processus. Nous analyserons la contribution de mutants de DNM2 provoquant la myopathie centronucléaire dans la formation des plaques de clathrine et l'intégrité du costamère dans plusieurs modèles expérimentaux incluant des souris DNM2 knock-in/knock-out ainsi que sur des cellules myogéniques issues de patients atteints de CNM.
Cette proposition a pour but d’établir un rôle nouveau, non conventionnel, pour la machinerie de l’endocytose dans la transduction de la force qui peut s’avérer impliqué dans le fonctionnement d’autres tissus. De plus, notre projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie des CNM et d’autres maladies neuromusculaires pour lesquelles l’intégrité du costamère est compromise mais aussi du cancer ou la fonction d'adhésion est perturbée conduisant à la migration cellulaire aberrante.