De l’identification de fragments à la découverte d’inhibiteurs de MabA (FabG1) un nouveau challenge pour traiter la tuberculose – 2FightTb

L’approche par fragments représente une nouvelle méthode pour le développement de petites molécules comme candidats médicaments. Cette approche implique l’utilisation de composés présentant un nombre limité d’atomes autres que des hydrogènes et une masse moléculaire inférieure à 300 g/mol. Ces caractéristiques confèrent à ce type de composés de meilleures propriétés physico-chimiques, en particulier en terme de solubilité, que des composés lead-like ou drug-like issus de chimiothèques généralistes. De plus en utilisant cette stratégie beaucoup moins de composés doivent être testés par rapport au criblage HTS classique et les approches par fragments ont montré un taux de réussite élevé pour l’identification de hits et la génération de composés leads.
Afin d’identifier des molécules capables d’inhiber l’enzyme MabA, un nouveau test enzymatique à haut débit basé sur la spectrométrie de masse a été développé et optimisé pour une utilisation en criblage au format 384 puits. Ce test consiste à quantifier par LCMSMS le produit de la réaction enzymatique en présence d’un inhibiteur potentiel. Une chimiothèque de fragments a été testée sur l’enzyme et les meilleurs inhibiteurs de MabA ont été sélectionnés et validés par des expériences de doses réponse. Des analogues de ces premiers inhibiteurs ont ensuite été synthétisés puis testés sur l’enzyme. Ceci a permis d’établir des relations structure-activité. Une chimiothèque de 240 composés a été synthétisée en phase solide afin d’augmenter rapidement la diversité structurale des composés et d’améliorer leur solubilité et leur stabilité en milieu biologique. Les meilleurs inhibiteurs ont été testés sur M. tuberculosis afin de mesurer leur capacité à inhiber la croissance bactérienne.

Afin d’identifier des molécules capables d’inhiber l’enzyme MabA, nous avons développé un nouveau test enzymatique haut débit, robuste et robotisable basé sur la LCMSMS. Ce test a été optimisé pour une utilisation en criblage au format 384 puits.
Deux criblages de 1280 et 2985 composés ont été réalisés en utilisant ce nouveau test enzymatique.
Les meilleurs inhibiteurs ont été sélectionnés et validés par des expériences de dose- réponse. Ceci a permis l’identification des premiers inhibiteurs de MabA de type petites molécules.
Les synthèses réalisées autour de plusieurs séries chimiques originales ont permis d’établir des relations structure-activité et les meilleurs inhibiteurs ont montré des IC50 sur l’enzyme de l’ordre du micromolaire.
Ces composés ont été testés sur Mycobacterium tuberculosis et plusieurs composés sont capables d’inhiber la croissance bactérienne.

Ce projet de chimie médicinale a permis d’identifier les premiers inhibiteurs de MabA (FabG1). Ces composés ont montré une bonne solubilité (> 100 µM) et une bonne stabilité plasmatique (t1/2 > 6h) et microsomale (t1/2 > 40 min) mais une forte liaison aux protéines plasmatiques (> 99.5%) ce qui limite leur utilisation pour une preuve de concept in vivo. De nouvelles pharmacomodulations sont en cours afin d’augmenter l’activité enzymatique et bactérienne des composés et d’optimiser leurs propriétés physico-chimiques et pharmacocinétiques. Ces composés seront utiles pour concevoir de nouvelles thérapies antibactériennes et surmonter la résistance aux médicaments existants.

Ces travaux ont fait l’objet de trois publications :

Kussau, T., Flipo, M., Van Wyk, N., Viljoen, A., Olieric, V., Kremer, L., Blaise, M. Structural rearrangements occurring upon cofactor binding in the Mycobacterium smegmatis beta-ketoacyl-acyl carrier protein reductase MabA. Acta crystallographica. Section D, Structural biology,2018, 74(Pt 5): 383-393.

Hugues Prevet, Marion Flipo, Pascal Roussel, Benoit Deprez, Nicolas Willand. Microwave-assisted synthesis of functionalized spirohydantoins as 3-D privileged fragments for scouting the chemical space Tetrahedron Letters 2016, 57, 2888

Ngoc Chau Tran, Heleen Dhondt, Marion Flipo, Benoit Deprez, Nicolas Willand. Synthesis of functionalized 2-isoxazolines as three-dimensional fragments for fragment-based drug discovery. Tetrahedron Letters 2015, 56, 4119.

Neuf communications par affiche ont été présentées dans des congrès nationaux et internationaux. Deux communications ont été récompensées par le prix du meilleur poster aux Journées Jeunes Chercheurs (2016 et 2018).

Selon les données les plus récentes, la tuberculose (TB), une maladie causée par Mycobacterium tuberculosis, entraîne plus de 1,7 millions de morts et 8,8 millions de nouveaux cas chaque année dans le monde. Le traitement de la maladie implique une chimiothérapie qui doit être administrée pendant six mois ou jusqu'à quatre ans pour le traitement des souches multi-résistantes aux antibiotiques (MDR-TB). Dans ce contexte, la thérapie est souvent associée à de graves effets secondaires, qui réduisent l'observance du patient et conduisent à des taux élevés de rechute et de mortalité. Des molécules actives contre des cibles jusque-là inexploitées sont évidemment nécessaires, et les récents efforts ont abouti à l'approbation de Bedaquiline, un inhibiteur sélectif de l'ATP synthase mycobactérienne. Cependant, de nouveaux médicaments ayant des modes d'action différents sont encore nécessaires afin de raccourcir les traitements et de stopper l'apparition de résistances.
Les acides mycoliques sont des acides gras à très longues chaînes qui jouent un rôle essentiel dans l'architecture et la perméabilité de la paroi de M. tuberculosis. La machinerie de biosynthèse des acides mycoliques, qui est la cible d’antituberculeux de première et seconde lignes, représente un réservoir important de cibles attrayantes. La protéine appelée MabA, également nommée FabG1, est impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques et catalyse la réduction NADPH-spécifique de dérivés beta-cétoacyles à longue chaîne. Des études génétiques ont montré que MabA était essentielle pour la survie de M. tuberculosis et cette enzyme représente une cible de choix pour démarrer un programme de découverte de médicaments. L'objectif principal du projet 2FightTb est d'utiliser des approches très innovantes pour développer de nouveaux inhibiteurs de MabA de faible poids moléculaire. Ces composés seront utiles pour concevoir de nouvelles thérapies contre la tuberculose, raccourcir le traitement et surmonter la résistance aux médicaments.
Le projet a débuté avec la découverte récente par le chercheur principal d'une série de petits fragments se liant à MabA. L'objectif fixé pour poursuivre ce travail est de concevoir des inhibiteurs « drug-like » de MabA à partir des fragments identifiés en se basant sur une variété de tests complémentaires. Pour atteindre l'objectif, un consortium pluridisciplinaire qui rassemble les compétences requises et les ressources techniques sera coordonné par le chercheur principal. Le plan de travail, inspiré d'un précédent projet (Willand et al. Nature Med. 2009, Flipo et al. J. Med. Chem. 2011 et 2012), comprend la conception rationnelle de molécules, guidée par la cristallographie aux rayons X et la modélisation in silico, combinée à des tests d'activité haut débit sur la cible et sur la bactérie (plateforme Equipex Imaginex) et au profilage ADME. Ce projet est complexe, car il nécessite un travail important à travers les frontières entre la chimie, la physique et la microbiologie. Cependant, nous croyons fermement qu’il est réalisable. En effet, le chercheur principal a démontré l’accessibilité chimique de MabA à travers le criblage d'une chimiothèque de fragments et le consortium a déjà collaboré avec succès pour identifier des candidats médicaments.
A la fin du projet, nous prévoyons d’obtenir un composé « lead » correspondant au profil suivant : une petite molécule, soluble en milieu aqueux, qui inhibe sélectivement MabA, avec une CI50 de l’ordre du nanomolaire, actif sur des souches sensibles et résistantes de M. tuberculosis avec une stabilité plasmatique et microsomale suffisante pour une preuve de concept in vivo.
MabA n'a pas encore démontré tout son potentiel comme cible thérapeutique mais le but de ce projet vaut l’investissement personnel et financier. En effet, de petits inhibiteurs de MabA, ciblant une enzyme non exploitée précédemment devrait tuer les souches sensibles et résistantes de M. tuberculosis.