Cinétique des inhibiteurs de protéines kinases et Affinité par Docking flexible – ChADock

La méthode in silico classiquement utilisée pour prédire les interactions protéin-ligand est l'amarrage moléculaire. Cependant et malgré les améliorations apportées à ces techniques ces dernières années, plusieurs limitations demeurent qui conduisent à fausser les prédictions. L'une des limitation majeure de l'amarrage moléculaire est son incapacité à prendre en compte la flexibilité du récepteur protéique.
La simulation de dynamique moléculaire est une méthode in silico qui permet de prédire les mouvement d'un système en tenant compte de son environnement. En combinant différente méthodes de simulation numériques (à différentes échelles de représentation du système, avec ou sans contraintes, etc...), nous pourrons pallier les insuffisances de l'amarrage moléculaire pour affiner les prédictions et guider les expérimentaliste vers la conception de composés actifs et innovants.

Développement de l'outil de prédiction :
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Le développement de cet outil consiste en trois étapes principales :
1 ) le développement d'un protocole de docking multi-conformations (l'objectif est d'enrichir le nombre de composés sélectionnés en limitant le nombre de faux négatifs)
2 ) la simulation de l'entrée des ligands dans le site actif (l'objectif est d'éliminer les composés faux positifs de l'ensemble des ligands potentiellement actifs )
3 ) la prédiction de la constante d'affinité et des constantes cinétiques.
Actuellement, nous avons effectué et validé l'étape 1 ) de ce processus.

Application à la conception d'inhibiteurs de la famille des LIMKs :
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Pour pouvoir réaliser cette étape du projet, des modèles par homologie des protéines LIMK-1 et LIMK-2 dans leurs formes actives et inactives ont été construits.

Développement de l'outil de prédiction :
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Le développement de l'outil de prédiction se poursuit actuellement par la deuxième étape, qui consiste à simuler l'entrée du ligand dans le site actif du récepteur. Cette entrée du ligand se divise en deux part distincts:
a) la diffusion du ligand jusqu'à une porte d'entrée privilégiée à la surface de la protéine.
b) le passage du ligand à travers la protéine pour parvenir jusqu'au site actif
Ces deux étapes seront appréhendées à l'aide de différentes méthodes de simulation numérique. Le processus complet d'association du ligand (diffusion puis passage à travers la protéine pour se fixer au site actif) sera utilisé pour ensuite prédire la constante cinétique d'association (kon).

Application à la conception d'inhibiteurs de la famille des LIMKs :
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Les modèles par homologie déjà construits vont être utilisée dans des approches de docking classique pour guider nos collaborateurs de synthèse dans la conception de nouveaux inhibiteurs des LMIKs à partir de leurs scaffolds propres. Ils seront également utilisés comme conformations de départ pour un échantillonnage conformationnel et un docking mult-conformations à partir de chimiothèques virtuelles, afin d'identifier de nouvelles têtes de séries potentielles susceptibles d'être optimisées par nos collaborateurs chimistes.

Ce projet à fait l'objet de 3 communication par affiche aux congrès suivants:
- Journées de la section régionale centre-ouest - Société Chimique de France, Orléans (France), 19-20 février 2015
- 4ème congrès du GT Enzymes et 19ème congrès du GGMM, Sète (France), 25-28 mai 2015
- 2nd Novalix conference Biophysics in Drug Discovery, Strasbourg (France), 9-12 juin 2015

Les interactions protéine-ligand sont au cœur de la majorité des processus biologiques. La conception de médicaments assistée par ordinateur, visant à caractériser ces interactions, a joué un rôle fondamental dans les récents développements en chimie thérapeutique. Les méthodes d’amarrage moléculaire ou docking se sont particulièrement développées, leur objectif étant de prédire l’affinité de liaison et les interactions entre une molécule et sa cible. Si de nombreuses améliorations ont été apportées à ces méthodes pour gérer la flexibilité du ligand ou améliorer les fonctions de score qui évaluent l’affinité de liaison ligand-récepteur, aucune méthode ne permet aujourd’hui de traiter correctement la flexibilité du récepteur lors de la fixation du ligand dans le site actif. Il est pourtant bien reconnu que la flexibilité du ligand et du récepteur jouent un rôle crucial dans la formation de ces complexes.
De plus, le docking consiste à positionner le ligand directement dans le site actif du récepteur, se focalisant sur la seule évaluation de l’affinité ligand-récepteur en occultant les aspects dynamiques et cinétiques du processus d’association. La prédiction du chemin d‘entrée du ligand et l’évaluation des constantes cinétiques de ce processus (kd, kon, koff) donneraient des informations précieuses sur la stabilité du complexe formé et sur la réelle efficacité du ligand.
L’objectif de ce projet est de développer une méthode permettant de sélectionner un ensemble de molécules potentiellement actives sur une cible donnée puis d’évaluer i) leur affinité de liaison (énergie libre d’interaction), ii) le chemin d’entrée emprunté par le ligand et iii) la constante cinétique d’association du mécanisme biologique (kon). Les composés les plus prometteurs seront synthétisés puis testés sur la cible d’intérêt pour confronter les prédictions aux données expérimentales.
La méthode sera d’abord développée et validée sur des ensembles récepteur-ligands extraits de la base de données DUD (a Directory of Useful Decoys). Nous nous focaliserons sur les protéines kinases qui possèdent des boucles hautement flexibles près de leur site de liaison à l’ATP. La méthode validée sera ensuite utilisée dans un projet de recherche interne pour concevoir de nouveaux inhibiteurs de la famille des protéines kinases LIMK.
LIMK1 et LIMK2, des serine/threonine et tyrosine kinases, constituent cette famille. Bien que structuralement proches (72,2% d’identité entre les domaines kinases), ces deux protéines ont des expressions, des localisations subcellulaires et des fonctions différentes. Elles sont impliquées dans plusieurs fonctions cellulaires comme la migration, le cycle cellulaire, la différentiation neuronale et dans des processus pathologiques tels que l’invasion tumorale et des désordres neurodéveloppementaux. Leur substrat majeur est la cofiline, un facteur de dépolymérisation de l’actine.
Les LIMK phosphorylent et inactive la cofiline, modulant la structure et l’activité du cytosquelette impliqué dans la morphogenèse, la motilité, la division, la différenciation et l’apoptose. Elles sont également impliquées dans la dynamique des microtubules lors de la mitose bien que son mécanisme moléculaire demeure inconnu. Considérées comme des cibles émergentes des traitements du cancer et notre méthode, en développant de nouveaux inhibiteurs des LIMK, permettra de développer de nouvelles thérapies anti-cancer.
Une perspective intéressante de ce travail sera d’aller plus loin dans la prédiction des données cinétiques en calculant la constante de dissociation (koff) du complexe protéine-ligand. En effet, il a été récemment montré que le koff constituerait un indicateur clé de la durée d’efficacité du composé in vivo et donnerait des informations sur sa sélectivité. La prédiction de ces données biochimiques serait un atout précieux pour la sélection et l’optimisation de composés précliniques. Cette méthode sera ensuite étendue à l’étude d’autres systèmes biologiques.