Dynamique de domaines dans le contrôle du flux d’électrons – DODYCOEL
Rôle de la dynamique et des mouvements de domaines dans le contrôle du flux d’électrons au sein d'une protéine multidomaine: la NADPH cytochrome P450 reductase
La dynamique des protéines multidomaines est un processus moléculaire important dans la catalyse enzymatique. La NADPH cytochrome P450 réductase (CPR) est le partenaire des cytochromes P450 impliqués dans la dégradation des xénobiotiques et la synthèse des hormones stéroïdes. Les domaines de la CPR sont en équilibre entre plusieurs conformations. Cependant, on connait assez peu les facteurs qui contrôlent cet équilibre et le rôle qu'ils peuvent avoir dans le fonctionnement de l'enzyme.
Développer une étude biochimique et fonctionnelle de la dynamique de RCR, axée sur la structure des domaines et de leurs interfaces comme déterminants fonctionnels pour le transfert d'électrons.
Nous avons montré qu’il existe des changements conformationnels au sein de la CPR. Ces changements conformationnels peuvent être potentiellement modifiés par des variations de séquences induites par le polymorphisme, et plus particulièrement pour le syndrome Antley-Bixler (ABS) pour lequel nous manquons d'interprétation structurale. En outre, la CPR, localisée à la membrane du réticulum endoplasmique, est présente avec une stœchiométrie défavorable par rapport aux cytochromes P450 (CYP). Nous ne comprenons pas encore complètement si ces différents facteurs sont critiques dans le contrôle de l’équilibre conformationnel. Nous proposons d’étudier ces phénomènes en: i) caractérisant les différents états conformationnels de la CPR au cours de son interaction avec divers accepteurs d'électrons naturel (CYP entre autres); ii) identifiant comment les CYP modulent potentiellement les différentes étapes du cycle de la CPR; iii) décrivant la les déterminants moléculaires qui modifient l'organisation structurelle et l’équilibre conformationnel. Les deux équipes apporteront leur savoir technique et scientifique: la biochimie, la dynamique des structures et l'évolution dirigée pour le partenaire français et la biochimie, la physiologie et la génétique moléculaire pour le partenaire portugais. Notre projet vise à mettre en relation une étude biochimique et une étude fonctionnelle de la dynamique de la CPR, ciblant les plus particulièrement le domaine de liaison et l'interface entre les différents domaines catalytiques comme principaux déterminants du transfert d’électrons aux différents partenaires.
Incorporation d'acides aminés non naturels dans la CPR
Échange de domaines
Étude fonctionnelle et conformationnelle des mutants Antley-Bixler de la CPR
Incorporation d'un acide aminé non naturel, purification et tests enzymatiques sur la protéine modifiée.
Incorporation de deux acides aminés non naturels, marquage avec des sondes fluorescentes
Echange de domaines entre CPR levure et CPR humaine
Aucune productionactuellement
La dynamique des protéines multidomaines est un processus moléculaire essentiel dans la régulation de la catalyse enzymatique. Les enzymes multidomaines appartenant à la famille des protéines de transfert d’électrons (TE) sont constituées de domaines transporteur et réductase ainsi que des domaines de jonctions. Ces protéines multidomaines sont sujettes à des changements conformationnels importants : le domaine transporteur doit se déplacer de sa position ou il récupère les électrons du domaine réductase à la position où elle donnera les électrons aux accepteurs naturels. Ces échanges conformationnels ont été mis en évidence chez la NADPH cytochrome P450 réductase (CPR), partenaire naturel des cytochromes P450 (CYP) qui participent à des réactions du métabolisme des xénobiotiques et de certaines hormones stéroïdes. Il est maintenant clairement établi que la CPR existe sous forme la d’équilibres conformationnels entre une conformation fermée et des conformations ouvertes. Toutefois, il existe peu d'informations sur les facteurs qui peuvent contrôler ces changements de conformation qui sont pourtant particulièrement pertinents dans des conditions physiologiques. Par exemple, l’interprétation de certaines variations induites par le polymorphisme du gène POR codant pour la CPR, et plus particulièrement les mutations présentes dans le syndrome Antley-Bixler (ABS) est insuffisante. En outre, la CPR interagit dans un environnement membranaire et avec une stœchiométrie défavorable (1:5-10) avec les différentes isoformes de CYP. Nous sommes également loin de comprendre comment le métabolisme global de plusieurs isoformes de CYP peut être est modulé par les transitions conformationnelles de la CPR. Notre projet se propose de comprendre, à différents niveaux moléculaires, comment la dynamique de la CPR détermine la répartition du flux électronique entre les différents accepteurs naturels. Les deux équipes apporteront leurs connaissances techniques et scientifiques: biochimie, dynamique structurale et évolution dirigée des protéines pour le partenaire français (Gilles Truan, LISBP, Toulouse) et biochimie, de physiologie et génétique moléculaire pour le partenaire portugais (Michel Kranendonk, Faculty of Medical Sciences, Department of Genetics, Lisbonne). Notre projet couplera une analyse biochimique à une étude fonctionnelle de la CPR, mettant en valeur les rôles structuraux des domaines de connexion et des interfaces des divers domaines comme déterminants fonctionnels pour le contrôle des TE aux CYP. Les résultats que nous obtiendrons au cours de ce projet auront un impact important sur notre vision de la dynamique des protéines de transfert d'électrons, dépassant le cas spécifique de la CPR, et pourront être étendus à d'autres protéines multidomaines. Par ailleurs, nos résultats devraient également améliorer considérablement notre compréhension du rôle régulateur des interactions entre la CPR et ses partenaires dans le métabolisme des xénobiotiques et des stéroïdes, une question clairement pertinente pour comprendre comment les conditions physiologiques modulent ces transformations enzymatiques. Nous pensons que ces questions ne peuvent être résolues que par une association intelligente de méthodes biochimiques et physiologiques et notre consortium est parfaitement adapté pour ce défi.
Coordination du projet
Gilles Truan (Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
Partenaire
LISBP Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés
Universidade Nova de Lisboa Faculty of Medical Sciences, Department of Genetics
Aide de l'ANR 204 984 euros
Début et durée du projet scientifique :
décembre 2013
- 36 Mois
