Assemblage différentiel de l’EJC – diffEnJCe

Les ARNm naissant sont couverts par une myriade de protéines qui spécifient leur devenir. L’identité de ces protéines est dictée par la séquence primaire de l’ARN ainsi que par sa maturation. Afin de décrypter les régulations post-transcriptionnelles, il est essentiel de décoder le mode d’assemblage de chaque particule mRNP. Le complexe EJC (Exon Junction Complex) illustre clairement l’impact de l’histoire nucléaire sur les fonctions des ARNm. L’EJC marque les jonctions exoniques produites par épissage et voyage avec les ARNm pour influencer leur localisation cellulaire, leur traduction et leur stabilité par le processus de NMD (Nonsense-mediated mRNA decay). Nous avons récemment établi la première carte transcriptomique des EJC par CLIP-seq (Crosslinking and Immunoprecipitation coupled to deep sequencing) dans les cellules HeLa. Cette étude illumina de nouvelles facettes de l’EJC et notamment sa présence et en quantité variable sur seulement 80% des exons mise au jour et son dépôt parfois loin de son site canonique. L’assemblage de l’EJC est donc bien plus complexe qu’attendu. Combiné au fait qu’il soit impliqué dans divers processus biologiques, il semble que notre vision des mécanismes par lesquels l’EJC module l’expression d’ARNm spécifiques reste floue.

L’objectif de ce projet est de découvrir si le dépôt et la composition de l’EJC sont régulés selon l’environnement cellulaire et de déterminer l’impact de cette régulation sur l’efficacité de traduction et la stabilité d’ARNm spécifiques au cours de la différenciation. Nos travaux seront organisés autour de trois questions :
(i) L’assemblage de l’EJC est-il régulé selon le type cellulaire ? Nous dresserons la carte des EJC par CLIP-seq dans différentes cellules dont des myoblastes différenciable en myotubes (Tâche 1) ainsi que dans des cultures primaires de cellules souches neurales (CSN) murines isolées du cerveau de nouveaux-nés et différenciable en cellules épendymaires (Tâche 2). De façon intéressante, nous avons observés que le niveau d’expression et la localisation cellulaire de certains composants de l’EJC varient dans ces types cellulaires. Combinés avec des analyses transcriptomiques, les cartes de l’EJC permettront d’identifier les ARNm différemment décorés par l’EJC. Des rapporteurs exprimant les événements d’épissage correspondant seront transfectés dans les myoblastes et les myotubes afin de valider et de disséquer la régulation de la présence des EJC.
(ii) La composition des EJCs varie-t-elle selon les junctions ? Nous déterminerons si les EJC sont associés aux mêmes effecteurs fonctionnels : MLN51 qui contribue à l’effet activateur de l’EJC sur la traduction et Upf3b qui lie l’EJC au NMD (Tâche 3). Nous identifierons les EJC associés ou non à MLN51 ou Upf3b par une approche de "double CLIP-seq" appliquée aux myoblastes, myotubes et CSN. Nous regarderons notamment si la composition des EJC canoniques et non-canoniques varie. Les exemples de régulation selon le type cellulaire seront validés à l’aide de rapporteurs.
(iii) La variabilité de l’EJC régule-t-elle la traduction et la stabilité d’ARNm spécifiques? Pour la traduction, nous mesurons de manière exhaustive le taux de traduction des ARNm par "Ribosome Profiling" dans les myoblastes, myotubes et CSN (Tâche 4). Pour le NMD, nous analyserons le transcriptome des différentes cellules dans lesquelles l’expression des facteurs de NMD, Upf1, Upf3b ou des protéines de l’EJC a été réduite avec des siRNAs (Tâche 5). Dans les deux cas, les événements associant une régulation de l’EJC à une modulation de la traduction ou du NMD feront l’objet de validations approfondies.

Nous pensons que l’étude d’un processus fondamental comme celui du modelage des particules mRNP au cours de leur maturation dans des cellules souches et différents états de différenciation illumineront de nouveaux modes de régulation de l’expression génique.