Nano-capteurs pour des études métaboliques à l’échelle de la mitochondrie – NANOMITO

Notre projet est fondé sur le développement d’électrodes de mesure et de fibres optiques, de dimensions comprises entre quelques microns et quelques dizaines de nanomètre. Ces capteurs seront utilisés individuellement pour analyser le métabolisme d’une mitochondrie ou assemblés en réseaux pour obtenir des « puces » analytiques. Celles-ci doivent permettre de mesurer de multiples activités de mitochondries, notamment à caractère pathologique.

-We developed microarrays for large scale-single mitochondria analyses. These were based on arrays of microwells, builded-up upon soft lithography (molding of a biocompatible polymer) or optical glass fiber structuration, for the isolation and observation of small populations of mitochondria in vitro. We succeeded in detecting the activity of single mitochondria disposed in each microwell of a large array. This permitted the monitoring of metabolic state variations (NADH, FAD, membrane potential, free radicals) of each mitochondrion under respiratory modulation. The goal of such analytical platforms is to compare metabolic states of mitochondria originating from different sources, tissues or cells.

- In parallel, we developed electrochemical microsystems, based on silicon chips integrating microelectrode arrays, for the simultaneous monitoring of oxygen and oxidative metabolites in vitro. We worked on the surface structuration and modification (platinum nanodeposits, enzymes) of platinum microelectrode arrays so as to detect hydrogen peroxide at nanomolar level in biological conditions in vitro. Our electrochemical chips allowed a direct quantification and kinetic study of the ratio between O2 consumption and H2O2 release by mitochondria, under modulation by respiratory activators and inhibitors.

Major perspectives of our micro and nanosensor systems include further studies and understanding of the correlations between metabolic parameters controlling the balance between redox signaling and oxidative stress in mitochondria.
Our studies are focused on single mitochondria detection since it should allow characterizing metabolic heteroplasmy between these organelles in a single cell or a tissue in diverse physio-pathological situations.

-Development of microwell arrays for single mitochondria studies with fluorescence detection:
Suraniti E. et al., Analytical Chemistry, 2013, 85, 5146-5152. Suraniti E. et al., Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2013, in press, “paper in Forefront”
- Development of integrated electrochemical microsystems for the detection of oxidative stress markers:
Ben-Amor S. et al, Electroanalysis, 2013, 3, 656-663. Ben-Amor S. et al, Electrochimica Acta, 2013, accepted.

Le projet NANOMITO a pour but de développer de nouveau outils analytiques et de nouvelles approches biophysiques pour étudier le métabolisme mitochondrial aux échelles micro à nano.
Nous partons du constat qu’une majorité des études des activités mitochondriales sont encore fondées sur l’utilisation d’outils spectrophotométriques et électrochimiques classiques. De ce fait, des questions fondamentales sur des voies métaboliques mitochondriales ne sont pas résolues. En particulier, il est démontré que les mitochondries sont un site majeur de production d’espèces chimiques réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS et RNS), ces espèces étant impliquées dans les processus de stress oxydant et nitrant, mais aussi dans la signalisation et l’homéostasie cellulaire. Cependant, la nature exacte des ROS et RNS impliqués dans ces processus, ainsi que leurs aspects cinétiques et quantitatifs restent très mal connus, ce qui est extrêmement limitant aussi bien pour des approches mécanistiques que thérapeutiques visant spécifiquement les mitochondries (traitement des « maladies mitochondriales »).
Nous nous sommes donc fixés pour objectif : (1) de développer de nouveaux capteurs permettant de détecter spécifiquement des marqueurs de la respiration, du métabolisme énergétique et du métabolisme nitro-oxydant (ROS et RNS) ; (2) de réaliser une détection simultanée de ces marqueurs afin d’obtenir une analyse multi-paramétrique du métabolisme mitochondrial; (3) d’effectuer des mesures exactes des concentrations ou flux de ces marqueurs (données quantitatives) ; (4) d’effectuer une détection in situ de ces espèces au niveau de la mitochondrie afin de caractériser leurs dynamiques de production/libération/diffusion (données cinétiques). L’ensemble de ces données permettra d’établir une nouvelle compréhension de la signalisation nitro-oxydante par les mitochondries au sein des cellules.
Pour atteindre ces objectifs, le projet NANOMITO sera fondé sur le développement de capteurs électrochimiques de dimension micro- à nanométrique, sélectifs pour les principales espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (O2•-, H2O2, NO, ONOO-), pour l’oxygène dissous et l’ATP. Ces capteurs seront mis en œuvre à trois niveaux de NANOMITO selon une approche top-down:,
- ils seront assemblés sous forme de microsystèmes et intégrés à des chambres oxygraphiques millimétriques pour réaliser des analyses multi-paramétriques sur une même population mitochondriale ;
- Ces chambres seront ensuite miniaturisées pour réaliser in situ les analyses sur une population de quelques centaines à quelques entités mitochondriales. De par la diminution des échelles d’espace et de temps, les espèces les plus labiles pourront être détectées et les variations statistiques analysées. Les microcellules électrochimiques seront assemblées sous forme de réseau afin d’effectuer des analyses en parallèle sur une multitude d’échantillons.
- En parallèle, nous réaliserons des réseaux de microcellules optiques à partir d’une structuration de fibres optiques. Les activités mitochondriales seront analysées au sein de ces microsystèmes spectro-photométriques grâce à des sondes fluorescentes perméantes ou non aux mitochondries. La comparaison des informations obtenues par les deux types d’approche méthodologique aura pour finalité de définir les localisations intra et extra-mitochondriales des espèces générées.
- finalement, nous mettrons au point des nanoélectrodes sélectives à certains ROS ou RNS, dans le but de pouvoir effectuer une mesure d’activité métabolique au niveau d’une seule mitochondrie, d’où le nom du projet NANOMITO. Nous travaillerons sur des mitochondries uniques isolées mais aussi sur des mitochondries uniques au sein d’une fibre musculaire cardiaque (détection in cellulo). Cette approche à l’échelle de l’entité sub-cellulaire aura pour but final de comprendre les activités nitro-oxydantes dans des conditions d’espace et de temps qui sont celles de la réalité biologique.