Biosenseurs FRET pour la dynamique spatio-temporelle d’activités kinase par FLIM rapide et anisotropie de fluorescence sous microscope – KinBioFRET

KinBioFRET a pour objectif de développer de nouvelles approches technologiques et méthodologiques en utilisant le fastFLIM pour la mesure d’heteroFRET quantitatif et en introduisant des mesures d’anisotropie de fluorescence pour les biosenseurs homoFRET.

Les approches méthodologiques développées seront directement utilisées pour étudier deux problématiques biologiques : (i) la comparaison de cellules en division de blastula et de gastrula en suivant simultanément la dynamique spatio-temporelle de l’activité kinase de MELK avec les tensions mécaniques dans l’embryon de Xénope, et (ii) la régulation spatio-temporelle de l’activité d’Aurora A en fonction du contexte de division cellulaire symétrique ou asymétrique dans la pupe vivante de Drosophile.

Ce projet est novateur et ambitieux pour différentes raisons : approche multidisciplinaire, développement de méthodes de microscopie de fluorescence quantitative dédiées aux biosenseurs FRET, développement de nouveaux biosenseurs FRET pour l’activité kinase d’Aurora A, développement de biosenseurs homoFRET par anisotropie de fluorescence, développement du suivi dynamique simultané de plusieurs biosenseurs FRET, nouveauté des résultats biologiques obtenus dans l’étude de la régulation de kinases au cours de la division cellulaire dans un organisme vivant en développement.

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Le projet KinBioFRET repose sur une combinaison originale de partenaires multidisciplinaires : une équipe de développement technologique et méthodologique (Marc Tramier) directement concerné par le développement des méthodologies associées aux biosenseurs FRET et trois partenaires biologistes (Jean-Pierre Tassan, Claude Prigent and Roland Le Borgne) directement intéressés par la dynamique des activités kinase dans différents champs de la biologie. Nous proposons de développer de nouveau biosenseurs FRET pour mesurer l’activité de deux kinases mitotiques essentielles, MELK et Aurora A, dans le cadre de la régulation spatio-temporelle de ces kinases au cours de la division cellulaire sur organismes modèles vivants génétiquement manipulables.
Premièrement, pour augmenter la sensibilité, la vitesse d’acquisition et ainsi la relevance biologique de ces biosenseurs, KinBioFRET a pour objectif de développer de nouvelles approches technologiques et méthodologiques en utilisant le fastFLIM pour la mesure d’heteroFRET quantitatif et en introduisant des mesures d’anisotropie de fluorescence pour les biosenseurs homoFRET. Deuxièmement, un des objectifs méthodologiques est de pouvoir suivre en même temps deux (ou plus) biosenseurs FRET en utilisant l’approche homoFRET. Nous l’effectuerons en mesurant simultanément dans l’embryon de Xénope l’activité de MELK et un senseur de tension Vinculin par une approche de biosenseurs homoFRET multicolores. En troisième lieu, nous allons développer de nouveau biosenseurs FRET pour étudier la régulation spatio-temporelle de la kinase mitotique Aurora A dans la Drosophile. Le choix d’Aurora A est intimement lié aux questions biologiques abordées par quatre groupes indépendants de l’IGDR. En plus d’une sonde mesurant le changement de FRET entre deux protéines fluorescentes en N-ter et C-ter d’Aurora, nous proposons de développer un biosenseur FRET d’Aurora A constitué d’un domaine de liaison à la phosphorylation reconnaissant une séquence peptidique substrat d’Aurora A avec aux deux extrémités une protéine fluorescente. Ce dernier biosenseur FRET contiendra différentes séquences de localisation subcellulaire aux centrosomes, aux centromères ou à la membrane plasmique.
Enfin, les approches méthodologiques développées seront directement utilisées pour étudier deux problématiques biologiques : (i) la comparaison de cellules en division de blastula et de gastrula en suivant simultanément la dynamique spatio-temporelle de l’activité kinase de MELK avec les tensions mécaniques dans l’embryon de Xénope, et (ii) la régulation spatio-temporelle de l’activité d’Aurora A en fonction du contexte de division cellulaire symétrique ou asymétrique dans la pupe vivante de Drosophile. Nous considérons que ce projet est novateur et ambitieux pour différentes raisons : approche multidisciplinaire, développement de méthodes de microscopie de fluorescence quantitative dédiées aux biosenseurs FRET, développement de nouveaux biosenseurs FRET pour l’activité kinase d’Aurora A, développement de biosenseurs homoFRET par anisotropie de fluorescence, développement du suivi dynamique simultané de plusieurs biosenseurs FRET, nouveauté des résultats biologiques obtenus dans l’étude de la régulation de kinases au cours de la division cellulaire dans un organisme vivant en développement.