Caractérisation moléculaire de l’assemblage et du fonctionnement enzymatique d’un complexe membranaire: la NADPH-oxydase – PROTOTYPE NOX

L’objectif du projet intitulé « Prototype NOX » est de mieux comprendre le fonctionnement de la NOX des phagocytes. Ce complexe enzymatique, est constitué au minimum de 5 protéines solubles et membranaires, ces dernières constituant la partie catalytique du complexe. Il associe (i) une dynamique d’assemblage de protéines, (ii) des transferts de charges et (iii) des réactions enzymatiques. Pour mieux appréhender l’importance, la synchronisation de ces évènements et les facteurs régulateurs de cet enzyme, nous avons développé un système oxydase acellulaire. Ce système consiste à recréer in vitro l’édifice moléculaire enzymatique avec les différentes protéines produites dans des organismes génétiquement modifiés (bactéries et des levures) pour des études physico-chimiques fines permettant d’aborder plus aisément l’étude de la relation structure-fonction. En parallèle, des études d’ingénierie de la sous-unité catalytique ont été menées dans le contexte cellulaire des phagocytes pour faire le lien entre propriétés moléculaires des NOX et leurs régulations par la signalisation cellulaire. Pour les études structurales, les quantités d’enzymes recombinantes requises sont telles qu’il a fallu rechercher des enzymes homologues dans le monde bactérien, plus facile à produire en grande quantité.

Au cours de ce travail, de manière inattendue, la partie catalytique de l’enzyme est apparue capable de générer seule des ROS, ceci étant également le cas pour les homologues bactériens découverts au cours de cette étude. La modification membranaire ou la modulation dans l’assemblage des différentes protéines semblent réguler l’activité enzymatique pouvant avoir des conséquences au niveau cellulaire du système immunitaire. Les enzymes homologues bactériens identifiés ont été produits et caractérisés, et ont permis d’avancer des études structurales. Les cristaux obtenus ouvrent une perspective prometteuse vers la première structure d’une enzyme de cette famille.

En identifiant, pour la première fois, des membres procaryotes de cette famille d’enzyme, des perspectives énorme voient le jour en termes de développement des études à venir structurales, un des objectifs initiaux du projet, mais aussi sur la fonction de ces systèmes dans le monde bactérien.
La reconstitution in vitro du complexe entier, entièrement issu de l’ingénierie des protéines, est capable, sous contrôle, de générer des radicaux de manière comparable à la situation in vivo. Cet outil permet de nous affranchir des contraintes cellulaires pour aborder aisément son étude physico-chimique. La flexibilité de ce système nous a permis de moduler la composition du complexe enzymatique, la composition de la membrane et les effecteurs (inhibiteurs, acide gras…). Ces études ont montré que les interactions entre protéine-protéine et lipide-protéine peuvent réguler son activité et que l’enzyme est particulièrement sensible à la stéréochimie de certaines molécules. Si le système de production hétérologue en levure ne nous permet pas pour l’instant d’avancer vers des études structurales, il nous ouvre la voie pour pourvoir étudier les autres membres de la famille des NOX bien plus difficile à manipuler.
Au-delà de l’aspect fondamental, ces systèmes notamment bactériens, plus facile à produire, ouvrent la voie à des développements économiques potentiels.

L’étude de l’activité de l’enzyme en système acellulaire et cellulaire a conduit à 6 publications dans des revues à comité de lecture (1 étant en cours de révision et 2 en cours de soumission). L’utilisation possible des enzymes bactériens identifiés par l’équipe de Pr. F Fieschi dans des pré-criblages haut débit pour l’industrie pharmaceutique a conduit au dépôt d’un brevet, puis à une étude de marché et maintenant à une phase de maturation d’une start-up (pilotée par J Dupuy). Les résultats issus de ce travail vont maintenant pouvoir être publiés (2 articles en cours de soumission et au moins 2 autres envisagés dans le futur).

La NADPH-oxydase est un complexe multiprotéique essentiel de la défense immunitaire innée présent dans les cellules phagocytaires. La NADPH-oxydase est devenu le prototype d’une famille d’homologues décelés récemment dans d’autres types cellulaires. Inactive dans la cellule au repos, cette enzyme a pour fonction de produire des anions superoxydes (O2.-) en réponse à divers stimuli de signalisation intercellulaire et en particulier à une infection bactérienne. Son activité est finement contrôlée par une dynamique d’assemblage de quatre protéines cytosoliques vers leur partenaire membranaire, le flavocytochrome b558 (Cytb558 ). Le Cytb558 est la composante catalytique de l’enzyme. Cet assemblage entraîne le transfert d'électron du substrat, le NADPH, à l'accepteur final, l'oxygène pour produire O2.- via une flavine et deux hème de type b. L’absence ou le dysfonctionnement de la NADPH-oxydase sont associés à de nombreuses pathologies.
Notre objectif est de mieux comprendre le fonctionnement complexe de cette enzyme qui associe des transferts d’électrons (et de protons) à une dynamique protéique, en utilisant une double approche structurale et fonctionnelle et des outils physico-chimiques, menée sur un système acellulaire (in vitro). De nombreuses questions sur son mode d’activation restent encore obscures en raison d’une régulation complexe (signalisation cellulaire, interactions protéiques multiples, implication de molécules activatrices..). Le facteur limitant majeur actuel pour son étude in vitro est lié à la composante membranaire catalytique de l’enzyme, le Cytb558 , qui reste difficile à obtenir en quantité suffisante. Nous avons levé récemment ce verrou important en mettant au point l’expression du Cytb558 recombinant dans la levure. Associé aux protéines cytosoliques recombinantes, le complexe forme un système modèle d’étude in vitro de la NADPH-oxydase. Notre objectif est donc de tirer profit de ce nouvel outil, affranchi des contraintes de signalisations cellulaires pour aborder plus aisément l’étude de la relation structure-fonction de cet enzyme tant au niveau des processus de son assemblage, la localisation de ses sites actifs ou bien des mécanismes qui contrôlent son activité. Ce projet met en jeu un large éventail de compétences et d’approches expérimentales (génie génétique, biochimie, biologie structurale, spectroscopie d’absorption et de fluorescence, radiobiologie), qui pour certaines n’ont pas encore été appliquées à l’étude de la NADPH-oxydase et devraient ainsi apporter des résultats très novateurs sur les éléments clefs modulant l’activation de l’enzyme. Les techniques de spectroscopie résolue en temps (technique de stopped-flow et radiolyse pulsée) seront utilisées pour déterminer finement la structure des intermédiaires réactionnels et caractériser les interactions substrat-protéine qui sont encore imprécises. L’influence de l’environnement physico-chimique sur ces mécanismes sera étudiée pour apporter des éléments de compréhension aux mécanismes d’activation ou d’inhibition de l’enzyme et aux interactions protéine-protéine. Ces résultats seront combinés aux données d'assemblage macromoléculaires obtenues à partir des études de fluorescence (stationnaire et dynamique), hydrodynamiques et de basse résolution (Biacore et ultracentrifugation analytique).
Enfin, nous avancerons vers la détermination structurale de la composante membranaire catalytique en prenant avantage des plateformes performantes disponibles. La connaissance de la structure tridimensionnelle de la composante catalytique de l’enzyme associée aux informations mécanistiques de son activation, sera déterminante pour définir des stratégies pharmacologiques permettant un meilleur contrôle dans les cas pathologiques de fonctionnement aberrant de la NADPH-oxydase. A terme, ce système pourra être extrapolé et exploité pour l’étude des NADPH-oxydases présentes dans les autres types tissulaires et beaucoup moins aisées à étudier.