Caracterisation structurale complete des formes ouverte et fermee d'un canal ionique de la famille des recepteurs cys-loop et mecanisme moleculaire de la transition – Nico_chimera

Pour comprendre en détail le mécanisme fonctionnel de ces canaux ioniques, nous utilisons des techniques de biologie moléculaire pour construire des chimères, d'électrophysiologie, pour vérifier que ces chimères sont fonctionnelles, de cristallographie aux Rayons X, pour résoudre leurs structures tridimensionnelles, et de simulation numérique et de dynamique moléculaire pour comprendre la transition ouverture/fermeture et la modulation par des ligands pharmacologiques.

-compréhension moléculaire de la modulation par l'alcool des récepteurs nicotiniques à l'aide de 6 nouvelles structures cristallographiques à resolution atomique
-meilleure compréhension de l'action des anesthesiques grace a la structure de complexes avec la nouvelle forme du récepteur bactérien, localement fermée (LC)
-caractérisation des transitions impliquant la forme LC par des simulations numériques de très longue durée (de l'ordre la micro-seconde)
-obtention de nouvelles chimeres fonctionnelles et caractérisation par électrophysiologie
-explication du mécanisme de perméation des ions à travers le canal par des techniques de dynamique moléculaire basées sur des nouvelles structures a plus haute resolution (2.4 Å)

Le projet a permis d’enrichir les schémas de fonctionnement des récepteurs par une nouvelle forme conformationnelle dite localement fermée (LC), ce qui appelle de nouveaux travaux pour en comprendre leur rôle fonctionnel précis. Des travaux actuellement soumis pour publication apportent également un éclairage nouveau sur la perméation des ions, dont la généralité restera à confirmer. Néanmoins il est impossible de parler des perspectives en termes d'applications ou d'impact sociétal à ce stade du développement du projet.

2 articles soumis et en cours de revision:
-L. Sauguet et al., EMBO J., soumis le 28 Juin 2012
-L. Sauguet et al., Nature Comm., soumis le 13 Juillet 2012

Notre but est d'obtenir experimentalement la structure a la fois de la forme ouverte et de la forme fermee d'au moins une meme molecule de la famille des canaux ioniques pentameriques declenches par un ligand, appreles CysLoop recepteurs; pour cela, nous voulons intensifier nos etudes structurales sur des dizaines de constructions differentes, essentiellement des chimeres entre eukaryotes et procaryotes en combinant leurs domaines extra-cellulaire et transmembranaire (ECD et TMD), mais aussi en manipulant le site de fixation de l'agoniste (Loops A,B,C,D,E,F). Les constructions seront guidees par des etudes de modelisation par homologie effectuees au prealable et guidees par la structure que nous avons recemment resolue au laboratoire (appelee GLIC; voir Bocquet et al., Nature, 2009), afin de se focaliser sur des molecules stereochimiquement plausibles. Elles seront testees fonctionnellement par electrophysiologie sur oocyte, pour verifier si le canal peut s'ouvrir sous l'effet de l'agoniste prevu. Puis, celles qui seront fonctionnelles seront testees en cristallisation par robot et leur structure resolue. Nous possedons deja au moins une construction chimere fonctionnelle, et qui donne des cristaux qui diffractent a basse resolution. Ce travail associera de facon tres proche une approche experimentale et computationnelle.
Les constructions de chimere seront testees en cristallisation en presence de l'agoniste et aussi en presence d'inhibiteurs du type anesthesique. Nous avons recemment montre la faisabilite d'une telle etude car nous avons resolu deja la structure a 3.2 Angstrom de GLIC en presence de deux anesthesiques differents, qui sont effectivement des inhibiteurs de l'ouverture de GLIC. Parallement, nous poursuivrons nos efforts pour tenter de comprendre l'activation de GLIC par les protons, ce qui demande des calculs assez sophistiques d'electrostatique dans un systeme membranaire. A cet effet, nous avons aussi recemment termine une etude par dynamique moleculaire de GLIC a pH neutre pendant 1 micro-seconde, dont l'analyse sera poursuivie et affinee. Enfin, lorsque nous disposerons d'une paire de structures dans les deux conformations extremes, nous lancerons des etudes de prediction de chemin de transition entre les deux formes, en particulier grace a une methode originale recemment mise au point par l'un d'entre nous, qui devrait permettre de predire quelles mutations seraient susceptibles de modifier la cinetique d'ouverture du canal. Ces predictions seront soumises a une verification experimentale.