Conception d'un microsystème basé sur des sondes électrochimiques ultra-sensibles pour une multi-détection sans marquage d'acides nucléiques: application au génotypage HCV – VirProbe

Le projet concerne la conception d'une plateforme de diagnostic miniaturisée (microsystème) innovante permettant le génotypage rapide du virus de l'hépatite C (HCV). Avec 170 millions de personnes infectées dans le monde dont 600 000 en France, HCV constitue un problème majeur de santé publique. L'infection par HCV est impliquée dans l'incidence croissante des hépatocarcinomes observée dans de nombreux pays développés dont le Japon, l'Espagne, la France et l'Italie pour lesquels la proportion attribuable au HCV est estimée entre 50 et 70 %. Ce projet se situe dans le domaine en pleine expansion et donc très concurrentiel des biopuces à ADN de basse complexité dont les applications sont les analyses dédiées, effectuées en nombre, nécessitant des équipements peu coûteux, simples d'utilisation voire portables et des consommables jetables. L?originalité du projet repose entre autre sur un mode de détection directe très sensible et sans marquage des cibles d'acides nucléiques. La réponse biologique du test est intimement liée aux séquences cible/sonde choisies. Le génotypage est un pré-requis nécessaire avant tout traitement (interféron pégylé/ribavurin) pour distinguer les patients répondeurs au traitement (génotypes HCV 2 et 3) des mauvais répondeurs (1 et 4) et définir un protocole antiviral optimal. Par ailleurs, le génotypage est indispensable pour effectuer une surveillance épidémiologique des souches circulantes. Une étude de séquences sur plus de 800 souches virales issues de donneurs de sang dépistés HCV (+) a déjà permis de sélectionner plusieurs sondes 18mères dans la région NS5b du génome viral permettant de différencier spécifiquement les sous-types majoritaires en Europe. Les séquences pertinentes pour le génotypage en NS5b seront identifiées et validées. Un panel (n = 300) de produits amplifiés de différents sous-types issus de plasma humains de donneurs HCV (+) sera constitué afin de valider les différentes étapes de développement. Le principal point innovant du projet réside dans la synthèse et l'étude d'une nouvelle famille de sondes électrochimiques pour la détection ultra-sensible d'acides nucléiques (ADN ou ARN) par électrochimie. Des oligonucléotides d'anomérie alpha (?-ODN) porteurs de nombreux groupements ferrocène (5 à 15) sur des liens internucléosidiques phosphoramidates ou phosphotriesters seront synthétisés et étudiés. Le positionnement des groupements rédox au plus proche de la région d'hybridation confère à ces sondes une extrême sensibilité. Des études préliminaires ont d'ores et déjà montré le maintien des propriétés d'hybridation des polyferrocenyl ?-ODN ainsi que leur bonne spécificité de reconnaissance. En effet, les ?-ODN modifiés gardent de bonnes propriétés d'hybridation contrairement aux ?-ODN modifiés. Une biopuce de multidétection fonctionnalisée par les différentes sondes d'intérêt pour le génotypage de HCV sera élaborée. Une chimie de greffage sur une surface d?or par la voie thiol sera étudiée dans un premier temps, sur un microcapteur à une électrode de travail. La caractérisation électrochimique du biocapteur sera menée de façon approfondie. Des mesures par voltamétrie cyclique, voltamétrie par pulses différentiels et par spectroscopie d?impédance seront notamment effectuées. La spécificité de reconnaissance des cibles par les sondes polyferrocenyl ?-ODN sera étudiée. Puis, une stratégie d'adressage de plusieurs sondes sur un réseau d'électrodes sera envisagée. Le greffage des sondes par électro-activation d?un sel d'aryl diazonium sera étudié. Cette chimie de surface va permettre une multi-fonctionnalisation de la biopuce. Une intégration de la plateforme d?analyse dans un système fluidique simple sera alors envisagée afin d'améliorer encore la sensibilité du test par une mesure en dynamique de la réaction d'hybridation sonde/cible. Nous espérons atteindre une limite de sensibilité de l'ordre de 10-15M. Les performances du microsystème seront étudiées en termes de spécificité, de sensibilité et de reproductibilité sur le panel biologique HCV (+) constitué.