– RETID(Y)NA

Les changements de conformation de protéines jouent un rôle vital dans les processus biochimiques. Ils peuvent varier de mouvements locaux de faible amplitude pendant le transfert d?électron à des mouvements de domaine très étendus souvent rencontrés dans la catalyse enzymatique. Dans ce projet, des mouvements délocalisés d?enzymes, de substrats, et de produits seront étudiés sur des intervalles de temps étendus en combinant une variété de types d?activation lumineuse avec des nouvelles techniques de FRET (« Fluorescence Resonance Energy Transfer ») intra-protéique. Le FRET a été appliquée très largement pour étudier des interactions protéine-protéine, typiquement en utilisant des fluorophores génétiquement fusionné à la protéine d?intérêt. Dans nos études, par contre nous incorporerons aussi bien des analogues d?acides aminés non-naturels en tant que marqueurs de FRET, aussi bien que nous utiliserons des chromophores naturellement présents dans la protéine, afin que l?ensemble permette le suivi de mouvements de domaines protéiques sans perturber la protéine elle-même. Dans les expériences de FRET, en général la fluorescence intégrée est mesurée, ce qui empêche la discrimination entre différentes configurations et limite la sensibilité de distance à l?ordre du radius de Förster (~50Å). Afin de combler ces limitations, la fluorescence sera détectée à la fois avec une résolution temporelle (femtoseconde) et spectrale pour accéder au régime de distances courtes (quenching fort) et permettre la discrimination de distributions de configurations et d?émission de fluorophores distincts. Le projet combine des compétences dans les techniques de spectroscopie avancée et de l?ingénierie de protéines et d?acides nucléique. Cela permettra de sonder des changements de distance et/ou d?orientation entre différents domaines protéiques pendant la transmission de signal, ainsi que des changements entre des protéines et leurs substrats lors des réactions enzymatiques. Nous développerons ces techniques pour une sélection représentative de systèmes protéiques impliqués dans la transformation et la régulation d?ADN et qui sont actuellement au c?ur d?une communauté de recherche active. Ils incluent 1) Le facteur de transcription senseur de CO CooA. Dans ce système, nous exploiterons la photolyse hème-ligand pour initier la signalisation, et nous visualiserons les importants mouvements de domaines protéiques, mouvements connus qui se produisent lors du basculement de l?état CO-ligandé et actif vers l?état non-ligandé qui n?est pas capable de lier l?ADN. 2) La thymidylate synthase ThyX, un enzyme essentiel pour la synthèse d?ADN de novo dans de nombreux pathogènes bactériens. Ici, nous exploiterons le fait que le substrat folate et le cofacteur flavine forment une paire FRET naturel. Les changements de conformation pendant la catalyse seront suivis en associant des approches de Stop-Flow et de FRET résolu dans le temps. 3) La nucléase NucS, qui a été découverte récemment. Dans ce système, nous emploierons le saut de température impulsivement induit par la lumière pour étudier la dynamique d?interactions protéine-ADN en utilisant le marquage à la fois de brins d?ADN et de l?enzyme. 4) La photolyase, un enzyme de réparation d?ADN naturellement photoactivable, un système modèle pour étudier le phénomène de basculement des bases de l?ADN. Nous suivrons en temps réel le re-larguage, hors du site catalytique, de paires de bases endommagées par la radiation UV puis réparées, après les étapes catalytiques ultra-rapides induites par la lumière, tout en utilisant des stratégies de marquage similaires aux précédentes. La disponibilité de structures pour tous ces systèmes protéiques facilite largement la faisabilité du projet. Ces développements peuvent être étendus à l?étude de la dynamique d?une grande variété de réactions catalytiques et de signalétiques, et finalement aussi à l?étude de la dynamique intra-protéine dans des systèmes intacts. Le projet s?appuie sur la forte synergie entre la spectroscopie biophysique, la biochimie, et la bioingéniérie, tout en étant épaulé par des approches de modélisation moléculaire. En s?appuyant sur le module expérimental de la FRET résolue en temps et en spectre, pour chaque projet les développements spécifiques d?enzymes modifiés et de méthodes de déclenchement de réactions prendront place de manière intégrés et imbriqués.