Régulation du fonctionnement des RCPG : hétéro-oligomérisation et organisation dynamique des récepteurs dans la membrane – GPCR D-I-F

Le mécanisme de signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) a été largement révisité, notamment parce qu?il a été montré que les récepteurs pouvaient former des homo- ou des hétéromères. De plus, la notion de RCPGs fonctionnant au sein d?un complexe multiprotéique spécifique ou ?signalosome? a émergé et a été renforcée par l?observation d?une diffusion confinée des RCPGs au sein de microdomaines de la membrane plasmique. Bien que les principaux processus biochimiques régulant l?activité des RCPGs aient été identifiés individuellement, les structures, la dynamique de chaque partenaire et les interactions protéine-protéine successives qui régulent ces évènements multi-moléculaires restent à déterminer. Le partenariat proposé, qui repose sur la pluridisciplinarité et l?expertise reconnue de biologistes, biophysiciens, chimistes et physiciens, a déjà produit des résultats significatifs dans le domaine des RCPGs et souhaite maintenant étendre encore les connaissances sur ces nouveaux concepts en développant et en appliquant des méthodologies innovantes. Nous nous concentrerons sur l?interaction entre récepteurs mu opioïde (MOP) et Neuropeptide FF (NPFF2). Le système NPFF est décrit comme régulant les réponses opioïdes afin de maintenir l?homéostasie. Le mécanisme impliqué dans la modulation des réponses opioïdes par le NPFF implique vraisemblablement une interaction fonctionnelle entre récepteurs dans la même cellule plutôt qu?une régulation due à la circuiterie neuronale. Ainsi, le traitement de neurones isolés ou de cellules modèles de neuroblastome humain SH-SY5Y par des agonistes NPFF réduit l?effet inhibiteur des agonistes MOP sur les canaux Ca2+ voltage-dépendants. Grace à des techniques de fluorescence, nous avons déjà montré dans ce modèle cellulaire que les agonistes NPFF entrainaient l?association des récepteurs MOP et NPFF (observé par transfert d?énergie de fluorescence), mais aussi modifiaient la mobilité latérale du récepteur MOP dans la membrane (observée par retour de fluorescence après photo-blanchiment à rayon variable ou vrFRAP). Nous devons maintenant comprendre comment cette interaction entre récepteurs à la membrane peut inhiber la signalisation du récepteur MOP. Les objectifs spécifiques du projet sont: 1)L?analyse détaillée par vrFRAP de la régulation des récepteurs MOP et NPFF2 (comportement dynamique et sa régulation par les agonistes et antagonistes, réciprocité et sélectivité de l?interaction). 2)La caractérisation du mécanisme moléculaire impliqué dans la modification de compartimentation du récepteur MOP induite par activation du récepteur NPFF2. 3)L?analyse du lien entre changement de mobilité latérale des récepteurs MOP et réduction de leur capacité à réguler les canaux calciques. 4)La démonstration de ces mécanismes sur des neurones dans lesquels l?effet anti-opioïde du NPFF a déjà été décrit. Plusieurs nouveaux outils et améliorations techniques seront développés afin d?atteindre ces objectifs : 1)un système de FRAP à deux couleurs qui nous permettra de suivre la diffusion des récepteurs NPFF et MOP simultanément, 2)des récepteurs modifiés, notamment fusionnés à la split GFP pour suivre spécifiquement la diffusion des dimères, 3)de nouveaux ligands, fluorescents pour marquer les récepteurs endogènes, et bivalents d? affinité accrue pour les héteromères afin d?explorer le lien entre diffusion et hétéromérisation. Ce projet pluridisciplinaire produira des avancées technologiques pour la microscopie par FRAP et la conception d?outils fluorescents. Il permettra aussi d?accroitre notre compréhension des mécanismes de ?cross-talk? entre RCPGs, avec l?élaboration de modèles de l?organisation dynamique des complexes de signalisation. En ce qui concerne le cas précis des interactions MOP/NPFF, l?identification de cibles et ligands permettant éventuellement de manipuler spécifiquement la signalisation transmembranaire du complexe fournira des pistes pour améliorer l?usage thérapeutique des opioïdes.