Chimiokines adhésives: structure moléculaire, imagerie cellulaire et outils thérapeutiques – Adhékines

Les chimiokines sont des cytokines chimiotactiques solubles exprimées par de nombreux types cellulaires. Il y a deux exceptions, CX3CL1 et CXCL16, qui sont produites sous forme membranaire. Ainsi, elles possèdent, avec leurs récepteurs respectifs, le CX3CR1 et le CXCR6, une propriété inattendue de molécules adhésives (d'où leur nom "adhékines"), qui sont impliquées, entre autres, dans la formation des plaques d?athérome et dans certains cancers. Leurs récepteurs sont, comme tous les récepteurs de chimiokines, des Récepteurs Couplés aux Protéines-G (RCPG) de la même classe que la Rhodopsine, pour lesquels le recouvrement ligand-récepteur est faible, et peut donc difficilement expliquer la capacité adhésive des couples CX3CL1/CX3CR1 et CXCL16/CXCR6. Par ailleurs, il semble que le couple CXCL16/CXCR6 n?a qu?une capacité limitée d?adhérence : contrairement au couple CX3CL1/CX3CR1, il ne résiste pas à l?adhésion sous flux. D?où nos questions : Comment un RCPG de la classe de la Rhodopsine et son ligand peuvent posséder une fonction adhésive ? Comment des différences minimes entre ligands (CX3CL1 et CXCL16) peuvent-elles donner une telle variation de fonction adhésive ? Notre projet relève donc clairement de la recherche sur des « bases fondamentales des processus biologiques ». Mais il se prolonge par l?identification de nouveaux composés anti-inflammatoires sur la base d?analogues des chimiokines : il consiste donc aussi en un « développement technologique innovant » et de « l?innovation thérapeutique » Nos premiers résultats montrent que, de manière surprenante, la chimiokine CX3CL1 est agrégée et probablement oligomérique, contrairement à CXCL16 [Hermand et al. J.Biol.Chem. 2008]. Cela indiquerait qu?une meilleure oligomérisation permettrait une meilleure interface adhésive. Enfin, certains signaux intracellulaires (Gi, RhoA) pourraient dans certains cas augmenter l?adhérence via CX3CR1/CX3CL1 [Daoudi et al. J.Biol.Chem. 2004]. Nous chercherons donc à comparer systématiquement les capacités d?adhérence des couples CX3CL1/CX3CR1 et CXCL16/CXCR6, à visualiser les molécules interactives durant l?adhérence intercellulaire, à trouver les caractéristiques fonctionnelles (agrégation, modification post-traductionnelle, transduction du signal) et les motifs structuraux (interface monomère/monomère, interaction ligand/récepteur) responsables des différences d?adhésion observées, aussi bien du côté des ligands que du côté des récepteurs. Notre projet comporte ainsi trois volets : - L?utilisation de la fluorescence avec le BRET et l?HTRF (collaboration avec CisBio International) permet de caractériser les propriétés d?agrégation des chimiokines et de leurs récepteurs aussi bien sur lignées cellulaires que sur cellules primaires. Par mutagenèse dirigée et troncation sélective, nous déterminerons les domaines protéiques responsables de l?oligomérisation observée. Pour mesurer la vitesse de diffusion, à partir de laquelle il est possible d?estimer le degré d?oligomérisation, nous utilisons la technique originale de FRAPP (blanchiment par franges d?interférence) qui est plus précise que le FRAP classique. - Outre les méthodes classiques (statique, sous flux), nous utilisons une technique originale pour quantifier l?adhérence intercellulaire : le doublet cellulaire est maintenu par deux micropipettes (collaboration UMR CNRS 8550), ce qui permet de mesurer directement la force d?adhésion. Cette technique sera complétée par la microscopie confocale, l?imagerie par homo-FRET et le FRAPP pour visualiser en direct la diffusion des molécules interactives et leur agrégation, avant ou pendant l?adhésion, hors ou dans l?interface adhésive. - Avec la modélisation moléculaire (collaboration avec l'unité INSERM U 773), et en particulier le « docking », nous analyserons les mécanismes sous-jacents aux déterminants des interactions récepteur/ligand, qui rendent compte de leurs différences fonctionnelles. Cela permettra d?orienter la recherche d?analogues de CXCL16 et CX3CL1 qui auraient des propriétés antagonistes ou « super-agonistes » et pourraient constituer le départ d?une nouvelle pharmacologie fondée sur les chimiokines. Ce projet interdisciplinaire rassemble des laboratoires dont les collaborations sont déjà effectives. Il concerne un domaine peu étudié, à savoir les mécanismes d?adhérence passant par des chimiokines adhésives impliquées dans la défense anti-tumorale, les maladies cardiovasculaires et certaines maladies neuro-dégénératives. Il développe une technique originale (suivi de l?adhésion, imagerie confocale et homo-FRET, mesure de la diffusion par FRAPP) qui pourrait servir dans d?autres cas d?interaction intercellulaire adhésive. Enfin, il produira des nouveaux anti-inflammatoires qui pourraient avoir des effets spécifiques sur les pathologies vasculaires, tumorales et neuro-dégénératives (DMLA par exemple)