Phosphorylation des récepteurs nucléaires de l'acide rétinoïque et interaction avec des adaptateurs à domaines SH3: Etudes structurales et fonctionnelles – VINRAR

Ce projet vise à déchiffrer d'un point de vue biophysique et biochimique comment un domaine non structuré comme le domaine N-terminal (NTD) régule l'activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires de l'acide retinoique (RAR). Les RAR se comportent comme des facteurs de transcription inductibles par leur ligand et contrôlent une multitude de phénomènes biologiques (embryogénèse, homéostasie, reproduction, prolifération et différenciation cellulaires, apoptose). Une panoplie d'etudes moléculaires et structurales ont montré que le ligand est l'interrupteur qui déclenche des changements conformationels du domaine de fixation du ligand (LBD), domaine bien structuré. Ces changements vont initier une cascade coordonnée d'association-dissociation de corégulateurs aboutissant à la communication du récepteur avec la machinerie transcriptionnelle. Cependant, à ce scénario, régi par le LBD, il faut ajouter l'intervention du NTD, bien qu?il ne soit pas structuré. L'équipe de C. Rochette-Egly a montré que le NTD des RAR renferme un motif riche en résidus proline avec une sérine qui devient phosphorylée en réponse à l?acide rétinoique . De plus, ce motif interagit avec des protéines adaptatrices à domaines SH3 ou apparentés comme la vinexine ? ou la profiline IIA qui sont aussi des proteines fixatrices de l'actine appartenant au cytosquelette. Le présent projet aura pour but de comprendre d'un point de vue biophysique et biochimique comment le motif riche en prolines du NTD participe à l'activité fonctionnelle des RAR. L'originalité du présent projet réside dans la mise en place d'une stratégie multidisciplinaire recouvrant les domaines de la biologie moléculaire, cellulaire et structurale, avec les axes principaux suivants. 1- Les aspects moléculaires, structuraux et thermodynamiques de l'interaction du motif riche en proline des RAR avec les domaines SH3 de la vinexine ? et de la profiline IIA. 2- L'impact de la phosphorylation du NTD sur (i) l'association/dissociation des domaines SH3, (ii) la structure et la dynamique du NTD et enfin (iii) la dynamique du domaine de fixation à l'ADN, domaine structuré adjacent. L'étude d'un tel cross-talk entre deux domaines sera possible en fusionnant le NTD au DBD grâce à la technique des 'inteins'. 3- Comment la vinexin ? et la profiline IIA contrôlent les propriétés transcriptionnelles des RARs via des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine. Cette approche sera complétée par la caractérisation des autres protéines qui échaffaudent les complexes RAR-vinexine ? et RAR-profiline IIA. Cette partie est particulièrement innovante car à notre connaissance, aucune connection entre les RAR et les proteines du cytosquelette n'a encore été mise en évidence. Dans le cas particulier de la vinexine ? qui renferme 3 domaines SH3, elle comprendra également une étude thermodynamique et structurale des interférences entre les trois domaines SH3. Ce projet associe les techniques classiques de la biologie moleculaire et cellulaire (construction de mutants, phosphorylation, immunoprecipitation), à des approches de modélisation numérique et à des techniques biophysiques (RMN, Biacore, FRET, SAXS), grâce au consortium formé par les équipes dirigées par C.Rochette-Egly, B.Kieffer and A. Dejaegere. Une telle stratégie multidisciplinaire devrait fournir les premières données thermodynamiques et structurales du NTD des RAR ainsi que les bases moléculaires de son rôle dans la régulation des propriétés transcriptionnelles du récepteur.