– Secretin

Les sécrétines constituent une famille unique de protéines de la membrane externe des bactéries impliquées soit dans la sécrétion de protéines soit dans l?assemblage de complexes multiprotéiques de la membrane externe. De manière originale, les sécrétines se différencient des porines car elles sont composées d?un grand nombre de sous unités formant un pore d?ouverture strictement contrôlé. PulD, la sécrétine la plus étudiée à ce jour, est très atypique. En effet, la protéine est résistante à la dissociation en détergent ionique même à 100°C, elle peut s?assembler et s?insérer spontanément dans une bicouche lipidique, elle ne requière pas la machinerie Bam pour son insertion dans la membrane externe, elle ne présente pas de brin beta amphipatiques clairement identifiables comme ceux des porines et enfin elle nécessite une chaperone pour sa protection vis à vis des protéases périplasmiques et pour son adressage vers la membrane externe mais pas pour son insertion dans la bicouche lipidique. Des problèmes techniques liés à la production, l?extraction et la purification des dodécamères de PulD ont restreint jusqu?ici les études structurales des sécrétines à l?analyse par microscopie électronique de particules isolées en détergent. Ces verrous technologiques ayant maintenant été levés, cela nous permet d?envisager dans ce programme des voies de recherches extrêmement encourageantes et excitantes pour l?analyse de la structure à haute résolution de PulD en liaison avec sa fonction. Une emphase toute particulière sera mise sur deux caractéristiques principales de PulD. Dans un premier temps, le complexe PulD sera produit dans le système in vitro que nous avons développé précédemment et sera purifiée en détergent non dénaturant par chromatographie d?affinité ou alors sera étudié directement par analyse de cristaux 2D en liposomes. Nous chercherons à déterminer quelles parties de la chaine polypeptidique de PulD traverse la membrane, contribue à la formation de l?oligomère et intervient dans la formation du bouchon du pore. Dans ce but , la cristallographie à 2 et 3 dimensions sera mise en oeuvre. Des méthodes de sélection et de criblage seront mises au point pour obtenir des mutations affectant l?ouverture du canal et la formation du dodécamère. Les variants affectés dans la formation du canal seront analysés in vitro pour analyser la structure ouverte du dodécamère. La cinétique d?assemblage des dodécamères ainsi que la recherche d?intermédiaires d?assemblage sera analysée en synthèse in vitro. Dans un second temps, nous examinerons les bases structurales de l?interaction entre PulD et sa chaperone PulS , tenterons de confirmer que les activités de protection et d?adressage de PulS sont bien indépendantes, et déterminerons l?influence de PulS sur la cinétique de repliement et l?assemblage de PulD. Enfin, nous examinerons également les différences entre PulS et deux autres chaperones bien caractérisées MxiM et PilW.