– REPVIR

Les nombreux virus à ADN double brin, qui infectent des souches hyperthermophiles appartenant au troisième domaine du vivant, les Archaea, présentent des propriétés radicalement différentes de ceux qui infectent les domaines Bacteria et Eucarya. Ils possèdent des morphologies uniques et diverses, et leurs génomes sont constitués de gènes putatifs dont 90% n?ont aucune fonction connue ou aucune homologie de séquence avec les autres virus ou porteurs d?information génomique. Dans la classification des virus connus, sept nouvelles familles virales ont été décrites incluant les virus en forme de fuseau nommés Fuselloviridae, les filamenteux Lipothrixviridae, les bâtonnets Rudiviridae, ceux formant des gouttelettes Guttaviridae, les sphériques Globuloviridae, ceux formant des queues Bicaudaviridae, et ceux en forme de bouteille Ampullaviridae. Notre connaissance de la biologie des virus de Crenarchea est très limitée principalement à cause du contenu unique de leurs génomes, et des faibles données disponibles sur les mécanismes de réplication de leur génome, et des protéines impliquées. La seule exception concerne le virus en forme de bouteille ABV, qui porte un gène de la famille B des ADN polymérase à ADN dépendant, vraisemblablement amorcée par une protéine. Cette situation est très différente de ce qui est connu chez les virus de Bacteria et d?Eucarya, qui possèdent presque tous, à quelques exceptions près, leur propre ADN polymérase à ADN dépendant. L?absence d?un gène connu codant l?ADN polymérase dans les génomes des virus d?Archaea hyperthermophiles, est intrigante, et spécialement si l?on considère les caractéristiques spécifiques de ces génomes viraux. Cela suggère que ces virus peuvent compter sur la machinerie de réplication de la cellule hôte, et donc seraient capable de modifier ou recruter celle-ci par une voie inconnue, de façon à promouvoir une réplication sélective de leur propre ADN et probablement d?agir sur le cycle cellulaire. Le but de ce projet est de rechercher et caractériser les protéines impliquées dans la réplication de l?ADN chez ces virus d?Archaea hyperthermophiles, et de comprendre les mécanismes de la réplication ainsi que sa régulation, incluant le détournement de la réplication cellulaire pour la synthèse de l?ADN viral. Comme modèles d?étude, nous avons sélectionné trois virus issus de trois familles différentes, pour lesquels nous avons obtenu quelques résultats préliminaires, et qui apparemment utilisent différents mécanismes et protéines pour la réplication de leur génome. Ce sont le virus SIRV1 de la famille Rudiviridae, qui infecte la souche hyperthermophile Sulfolobus islandicus, le virus filamenteux AFV1 (Lipothrixviridae) et le virus ABV (Ampullaviridae) qui infectent chacun des souches d?Archaea hyperthermophiles du genre Acidianus. Les problèmes de la réplication de chacun de ces trois virus seront abordés de différentes façons, en fonction des informations disponibles et des particularités du système hôte-virus. Ainsi, les études sur la réplication d?ABV incluront principalement la caractérisation d?une ADN polymérase recombinante et d?une protéine putative liée en position terminale au génome linéaire, qui amorcerait probablement la réplication. Et tout ceci sera fait dans le dessein de démontrer l?intérêt biotechnologique de cette enzyme pour l?amplification d?ADN de génome entier et pour la PCR de longs fragments, d?après ses propriétés potentielles de haute thermostabilité et de grande processivité. Pour les virus SIRV1 et SIFV1, pour lesquels aucune ADN polymérase n?a été trouvée, le principal objectif serait de comprendre le mode de réplication virale, et de générer et vérifier les hypothèses d?implications des protéines virales et cellulaires dans le processus. Les origines de réplication seront localisées, et sur la base de ces résultats, les protéines virales responsables de l?initiation seront identifiées. La détection de réseaux de protéines virales et cellulaires interagissant entre elles, de fonction connue ou non, nous aidera à élucider le rôle de chaque protéine dans la machinerie de réplication pour ces deux virus. Des analyses biochimiques seront élaborées et réalisées à partir des fonctions hypothétiques de ces protéines. Ces résultats nous permettront d?émettre des hypothèses concernant les mécanismes de réplication de chacun de ces deux virus, et certaines pourront être vérifié par la visualisation des intermédiaires de réplication en microscopie électronique. Des observations préliminaires suggèrent que la réplication de l'ADN pourrait se produire au niveau de sites spécifiques dans les cellules infectées par SIRV1. Nous prévoyons de caractériser ces sites en utilisant les techniques de microscopie électronique après cryo-fixation. Nous envisageons également d'analyser les liens entre ces sites et la réplication de l'ADN par immuno-électron microscopie à l'aide d'anticorps dirigés contre des protéines présumées de réplication.