Analyse quantitative de la régulation catabolique dans des cellules bactériennes vivantes et uniques par imagerie et spectroscopie de fluctuation de fluorescence – QuantinBaCell

La compréhension complète des processus cellulaires dans toute leur complexité nécessite non seulement la caractérisation détaillée in vitro des propriétés et des interactions des macromolécules clefs impliquées, mais encore la caractérisation quantitative de leur comportement dynamique dans le contexte de la cellule vivante. De telles études, qui sont maintenant possibles à l?aide de nouvelles approches de biophotonique, fournissent des valeurs numériques permettant des simulations informatiques en biologie des systèmes ou l?évaluation de l?efficacité de molécules actives sur des cibles cellulaires. Le but de ce projet est de réaliser pour la première fois la caractérisation quantitative in vivo de protéines régulatrices bactériennes dans des cellules vivantes uniques de Bacillus subtilis, principalement grâce à des techniques d?imagerie et de spectroscopie de fluctuation de fluorescence. Les premiers régulateurs étudiés seront deux répresseurs transcriptionnels, CggR et CcpN, impliqués dans la régulation du métabolisme central du carbone (CCM), sur lesquels les partenaires 1 et 2 ont déjà acquis des informations génétiques, biochimiques et structurales détaillées. CggR et CcpN contrôlent l?expression de gènes glycolytiques et néoglucogèniques centraux afin d?adapter l?intensité et la direction du flux central de carbone à la nature et à la quantité des sources de carbone disponibles. Des homologues de ces protéines et de leurs partenaires sont retrouvés dans des voies métaboliques clefs, non seulement dans d?autres taxons bactériens mais aussi chez des eucaryotes. Un microscope de spectroscopie de fluctuation de fluorescence et d?imagerie bi-photonique (2P2CFFS) a récemment été installé et utilisé avec succès dans le laboratoire du Partenaire 1 pour quantifier des interactions moléculaires impliquant des facteurs de transcription eukaryotes dans le noyau de la cellule. Nous adapterons cet outil pour des mesures de molécules uniques dans des cellules de B. subtilis exprimant des protéines marquées construites et caractérisées à l?échelle de la population cellulaire par le partenaire 2. Des expériences préliminaires montrent qu?avec notre système 2P2CFFS il est possible de mesurer la concentration intracellulaire de GFP dans des cellules de B. subtilis. D?autres méthodes innovantes d?imagerie et de spectroscopie basées sur cette technique seront développées pour procéder à une étude en profondeur des mécanismes de régulation du CCM dans des cellules bactériennes vivantes uniques. La première application sera de déterminer le niveau et la dynamique d'expression d?opérons cataboliques du carbone au cours de modifications environnementales. Pour cela, nous utiliserons un ensemble de souches de B. subtilis déjà étudiées par le Partenaire 2, et qui expriment la GFP sous le contrôle de différents promoteurs d?intérêt concernant la régulation par CggR/CcpN. Nous appliquerons ensuite l'ensemble des méthodes biophotoniques à notre disposition pour collecter des données quantitatives sur les propriétés intracellulaires de ces répresseurs (localisation, concentration, mobilité, état oligomérique), ainsi que pour détecter et quantifier leur degré d?interaction avec des protéines partenaires présumées. Pour cela, nous construirons des souches de B. subtilis produisant les protéines fusionnées à des variants de la GFP adaptées aux applications bi-photomiques. Les mesures seront effectuées sur un grand nombre de cellules sélectionnées au hasard afin de fournir des informations sur les fluctuations stochastiques entre cellules individuelles, en particulier lors d?une transition nutritionnelle. Parallèlement, nous conduirons des études comparatives in vivo sur des populations cellulaires par la technique de Live Cell Array développée par le Partenaire 2, et nous caractériserons aussi in vitro les protéines fluorescentes en solutions diluées ou complexes mimant l?environnement cellulaire. En cas de succès, les études proposées établiront l?intérêt d?approches biophotoniques pour la quantification in vivo de bio-molécules et d?interactions moléculaires dans des cellules bactériennes vivantes, ouvrant ainsi la voie à un vaste champ jusqu?à présent non exploré d?applications pour l?analyse de voies de signalisation et d?autres processus microcellulaires fondamentaux. Dans le cadre de ce projet nous explorerons aussi les variations temporelles, spatiales et stochastiques de l'expression des gènes dans des cellules bactériennes individuelles, ainsi que l'origine de discordances entre les données quantitatives in vivo vs in vitro, ou en cellules uniques vs populations bactériennes. Ces études constitueront une étape décisive pour progresser vers une compréhension intégrée des processus moléculaires dans des cellules vivantes et se diriger vers des approches systémiques et de biologie des systèmes.