Caractérisation des mutations et des cibles des gènes mutateurs à l'échelle du génome – MUTome

Les organismes sont en conflit permanent pour conserver et diversifier leur génome. Ils ont besoin d?une stabilité suffisante pour copier toute l?information génétique initiale, mais à long terme, un faible degré d?instabilité est profitable aux espèces, car il leur permet de créer la diversité génétique sur laquelle agira la sélection. Ces dernières années, les avancées dans le domaine de la mutagenèse et des réponses aux dommages de l?ADN ont été considérables. Plusieurs des mécanismes-clés de la réponse cellulaire aux dommages ont été largement analysés et reconnus pour leur rôle dans les maladies génétiques et le cancer. Afin d?élucider ces processus de réparation complexes, nous nous proposons de réétudier les profils mutationnels à l?échelle du génome, en s?appuyant sur les récentes avancées des technologies de séquençage à haut-débit (HT-SEQ). Cette approche originale présentera l?avantage sans précédent de vaincre la limitation intrinsèque des essais basés sur des systèmes rapporteurs artificiels, en fournissant des informations objectives à l?échelle de toutes les cibles naturelles. Pour interroger les profils mutationnels à l?échelle du génome chez la levure modèle S. cerevisiae, nous aurons recours au séquenceur Applied-SOLiD de la plate-forme de l?Institut Curie, qui permet de générer jusqu?à 4 GB de fragments de 35pb de longueur en une semaine (soit >107 fragments). Ceci est l?équivalent d?environ 200 génomes de S. cerevisiae. Grâce au séquençage de fragments et à l?utilisation de librairies de paires de séquences appariées, permettant de séquencer les deux extrémités d?un fragment sélectionné d?une taille de 1 à 15 kb, nous pourrons détecter toutes sortes d?événements mutagènes : ponctuels, petites insertions-délétions, et importants réarrangements de chromosomes incluant les translocations, insertions, inversions et changement du nombre de copies de chromosomes. Dans ce projet, nous souhaitons établir: 1) le spectre de mutation spontanée des souches haploïdes sauvages et diploïdes homozygotes par génération et par cellule, puis l?utiliser comme génome de référence ; 2) la fréquence et la nature des mutations chez les souches mutantes rad27?, pif1?, mre11?, mh2?, tsa1?, tho2?, cac1? cac3? et mec1? tel1? sml1?. Ces gènes jouent un rôle dans différents processus du métabolisme de l?ADN, le contrôle de la progression du cycle cellulaire et l?assemblage de la chromatine. L?inactivation de ces gènes a un fort effet mutateur que nous souhaitons étudier qualitativement et quantitativement à l?échelle du génome. L?utilisation de la technique de pedigree qui permet de séparer la cellule mère de la cellule fille, dans les souches WT et mutantes va permettre de détecter des évènements mutationnels se produisant en une seule génération ; 3) Enfin, nous souhaitons déterminer si le passage par la méiose des cellules diploïdes est anormalement mutagène dû au niveau élevé de formation de cassures double-brin dans l?ADN. Cette approche permettra de cartographier les régions chromosomiques préférentiellement ciblées par la mutagenèse et devrait fournir une image jamais encore dévoilée de la contribution relative de l?architecture du génome (régions codantes vs non-codantes, domaines de la chromatine, structures secondaires de l?ADN) qui joue un rôle en protégeant l?ADN des événements mutationnels ou au contraire en les favorisant. Au total, au moins 20 séquençages à haut-débit seront effectués, correspondant à l?équivalent de 4000 génomes de levure.