– LimoPhosProt

Chez de nombreuses bactéries pathogènes, la phosphorylation des protéines représente un des mécanismes qui contrôlent leur virulence. Dans ce projet, nous étudierons les mécanismes par lesquels les protéines du système phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase (PTS), un système de transport de nombreux sucres, contrôlent l?activité de PrfA, le régulateur de la virulence chez L. monocytogenes. Nous construirons une série de mutants affectés dans des composants PTS spécifiques du glucose et du cellobiose, les 2 sources de carbone qui inhibent le plus fortement l?activité de PrfA et dans le transporteur non-PTS de glucose GlcU. Des allèles mutés codant pour des formes non-phosphorylables ou qui miment la phosphorylation de ces protéines seront insérés en position ectopique dans la région int-comK de L. monocytogenes. L?effet de ces mutations sur l?activité de PrfA sera testé. Parmi ces mutations, celles qui affectent la fonction de PrfA seront également étudiées dans des modèles d?infection in vivo afin de tester leur effet sur la virulence. Afin de mettre en évidence, par des approches in vitro, que les interactions entre PrfA et les composants du PTS dépendent de leur état de phosphorylation, les protéines du PTS et PrfA seront également purifiées et des études d?interactions protéine/protéine seront réalisées au moyen de plusieurs techniques (expériences de spectroscopie de la résonance plasmon, pull-down et retard d?élution). Nous déterminerons, par une approche globale, le Ser/Thr/Tyr phospho-protéome (P-protéome) de L. monocytogenes en utilisant les dernières avancées technologiques en spectrométrie de masse (LTQ Orbitrap) et des logiciels spécifiquement développés pour l?analyse des données du P-protéome (MSQuant). Ces expériences seront réalisées avec la souche sauvage EGDe (dans différentes conditions de culture), certains mutants protéine kinase/P-protéine phosphatase ainsi qu?une souche prfA* (remplacement Gly145Ser ; PrfA constitutivement actif) dérivé de EGDe seront également analysés. Parmi les P-protéines identifiées, celles qui jouent un rôle dans des voies métaboliques majeures ou impliquées dans des fonctions cellulaires importantes seront plus particulièrement étudiées. Des mutants inactivés pour ces différentes protéines seront construits. Les protéines seront également purifiées et caractérisées biochimiquement. L?effet de la phosphorylation sur leur activité sera testé in vitro et in vivo. Ceci permettra de mieux comprendre les réseaux de régulation globale de ce pathogène. Les P-protéines potentiellement impliquées dans la virulence de L. monocytogenes seront identifiées. Des mutants par délétion seronts construits. Les allèles mutés codant pour des formes non-phosphorylables ou qui miment la phosphorylation de ces protéines seront également obtenus. Afin de permettre d?identifier les P-protéines dont les gènes présentent un niveau d?expression altéré au cours du processus infectieux ou lors de conditions de cultures spécifiques, les données des P-protéomes seront comparées aux résultats récents issus de l?analyse des transcriptomes de L. monocytogenes dans le laboratoire du partenaire 3 après croissance dans l?intestin de souris axéniques et dans le sang humain. Des analyses transcriptomiques additionnelles et des tests de virulence seront réalisés sur des mutants spécifiques. Nous déterminerons la capacité des bactéries à entrer et à se multiplier dans les cellules épithéliales humaines infectées. La capacité de survie des mutants sera étudiée par mesure de la DL50 et par mesure de leur capacité à se multiplier dans le foie et la rate de souris infectées après inoculation intraveineuse. Des infections orales chez le cobaye ainsi que chez la souris transgénique modifiée seront également réalisées afin d?étudier l?effet des mutations sur les étapes précoces de l?infection.