Recombinaison homologue et synthèse translésionelle dans la variabilité génétique chez Helicobacter pylori: role des protéines RecJ, RecN et PolA – HPGenVar

A travers une combinaison d'approches bioinformatiques, génétiques, biochimiques et biophysiques nous proposons d'étudier les fonctions de trois protéines impliquées dans le maintien de la stabilité génétique et la plasticité génomique de H. pylori: RecJ, RecN et PolA. Les deux premières, censées participer à la recombinaison homologue, ont des fonctions mal définies même dans les systèmes modèles comme E. coli et B. subtilis. Nos résultats préliminaires montrent que chez H. pylori, une souche mutante dans le gène recJ mais sauvage pour les autres gènes de réparation et recombinaison, a un phénotype de sensibilité aux agents génotoxiques extrêmement marqué. Nous comptons donc réalisé une dissection génétique des fonctions de recombinaison pour identifier la ou les voie(s) auxquelles participe RecJ. Au niveau biochimique, les activités enzymatiques de cette exonucléase putative seront analysées après purification de la protéine et en utilisant divers substrats ADN. Pour contribuer à la détermination de ses rôles, les partenaires protéiques de RecJ seront investigués. Les interactions physiques seront étudiées par des méthodes biophysiques et modélisées pour générer des formes mutantes permettant l'étude de l'impact physiologique de l'interaction. Dans le cas des protéines RecN, encore moins est connu sur leur fonction. Nous avons mis en évidence que, comme c'est le cas pour RecJ, chez H. pylori un mutant RecN montre une forte sensibilité aux agents génotoxiques d'où l'on déduit que soit cette protéine a une fonction différente que ses orthologues chez E. coli ou B. subtilis, soit dans ces organismes sa fonction principale est masquée par des systèmes redondants. L'approche que nous utiliserons pour dévoiler le rôle de cette protéine de la famille des SMC est similaire à celle décrite pour RecJ: étude des phénotypes des mutants simple ou multiples, modélisation, purification et analyse biochimique, recherche de partenaires, étude biophysique des complexes. Finalement, suite à des résultats préliminaires de nos laboratoires, nous explorerons le rôle de la polymérase PolA dans la synthèse de translésionelle (TLS). Effectivement, H. pylori ne possède apparemment que deux ADN polymérases: la replicative Pol III et PolA. Aucun gène codant pour une polymérase de TLS a été identifié. Nos études de modélisation suggèrent que PolA a un site de "proofreading" inactivé par des remplacements d'acides aminés. Nos études de mutagenèse montrent qu'une souche où cette polymérase est inactivée a un phénotype hypo-mutateur alors qu'une souche qui surproduit la protéine est hypermutatrice. Plus concrètement, nous avons montré que la protéine purifiée est capable de polymériser à travers un site abasique, lésion bloquante pour la plupart des polymérases non-TLS. Ces données sont cohérentes avec un rôle de PolA dans la TLS. Nous étudierons donc cette hypothèse par la dissection génétique utilisant comme phénotypes la mutagenèse spontanée et induite, la recombinaison intra et extrachromosomique et la sensibilité des mutants à des divers agents génotoxiques. La protéine purifiée sera caractérisée au niveau biochimique (activités enzymatiques, affinités pour des substrats) et biophysique (caractérisations des complexes protéine ADN, structure en présence de divers substrats ADN). Ces études seront possibles grâce à la complémentarité des deux équipes participantes. Le partenaire 1 étudie depuis plusieurs années les systèmes de réparation de l'ADN et de recombinaison homologue utilisant plusieurs modèles et en particulier celui de H. pylori. Dans ce dernier, le groupe compte avec tous les outils génétiques pour l'études des fonctions in vivo. En plus il a une longue expérience dans la purification et la caractérisation boichimique des protéines du métabolisme de l'ADN. Le partenaire 2 a de son côté une grande expertise dans les études bioinformatiques (modélisation des protéines et ses complexes) et biophysiques (RMN, cristallographie, calorimétrie, etc?) des protéines liées au maintien de la stabilité génomique, et en particulier des complexes protéiques. L'ensemble des résultats permettra non seulement mieux comprendre les mécanismes à la base de la plasticité génétique d'un important pathogène, mais aussi fournira des éléments pour dévoiler le rôle de protéines hautement conservées pour lesquelles la fonction est pas tout à fait connue.