Initiation de la recombinaison méiotique chez la souris – Hotspots

La formation des crossing over en méiose procède d?un mécanisme de formation et réparation de cassures double brin de l?ADN (CDB). Chez la souris, on estime qu?environ 300 CDBs sont induites en début de prophase de cellules méiotiques (ovocytes et spermatocytes). La formation des CDBs doit être à l?évidence étroitement régulée en fréquence et en localisation, selon des mécanismes encore inconnus. Nous avons étudié ces dernières années chez la souris plusieurs aspects de la protéine Spo11 (qui porte l?activité catalytique de formation des CDBs) ainsi que les propriétés d?un site de crossover, appelé Psmb9. Nos résultats récents nous conduisent à mettre en place, dans la continuité de nos travaux, un projet à grande échelle impliquant par des approches complémentaires l?ensemble de l?équipe. Ce projet a pour objectif d?aborder deux questions complémentaires relatives à l?étape cruciale de formation de CDBs : 1) Quelles sont les protéines impliquées (autres que Spo11) ? 2) Comment sont définis les sites de CDBs dans le génome ? 1) Bien que chez S. cerevisiae, plusieurs protéines sont nécessaires à la formation des CDBs (telles Mei4, Rec114, Mer2?). Ces protéines n?ont pas d?activité connue. Certaines interagissent (Mei4 et Rec114 par exemple) mais elles n?ont pas été retrouvées chez d?autres espèces (multicellulaires) à ce jour. Sur la base d?alignements protéiques, nous avons identifié récemment chez M. musculus (et chez d?autres eucaryotes) les orthologues putatifs des protéines Mei4 et Rec114 de S. cerevisiae. Nous allons développer l?analyse fonctionnelle complète des gènes correspondants : expression, interactions, localisation des protéines, obtention et analyse des souris Mei4KO et Rec114KO. 2) Il a été clairement établi, en particulier chez la souris et l?homme, que la recombinaison n?est pas distribuée de manière aléatoire dans le génome mais a lieu préférentiellement dans des petites régions (environ 1Kb) appelées hotspots. Ces régions, qui correspondent aux sites préférentiels d?initiation, sont espacées en moyenne de 100Kb et ont des niveaux de recombinaison très variables. Nos analyses du hotspot murin Psmb9 nous ont conduit récemment à l?identification d?un locus, appelé Dsbc1 (pour Double strand break control 1) qui possède des propriétés inattendues et particulièrement intéressantes : Nous avons identifié deux allèles de Dsbc1 dans deux fonds génétiques et montré que selon l?allèle présent une région du génome peut avoir une activité de recombinaison basse ou élevée. Notre objectif est d?identifier le gène correspondant à Dsbc1 et d?élucider son mécanisme d?action. Nous testerons plusieurs gènes candidats par transgénèse, compte tenu que les deux allèles de Dsbc1 ont des effets distincts sur la distribution de la recombinaison. D?autre part, des analyses de modifications d?histones au hotspot Psmb9 suggère que Dsbc1 influe sur la structure de la chromatine et pourrait être un des éléments clefs du contrôle de la localisation des hotspots. Nous développerons une analyse systématique de modification d?histones sur des spermatocytes à l?échelle du génome entier par ChipSeq. Nous chercherons à identifier de nouveaux hotspots par cette analyse. Enfin, nous tenterons de développer des nouvelles approches et protocoles pour cartographier à l?échelle du génome entier les événements de CDBs afin de pouvoir rechercher à grande échelle des corrélations initiation de la recombinaison/chromatine. En conclusion, nos approches complémentaires viseront à élucider l?étape d?initiation de la recombinaison de la souris, en progressant dans l?identification des protéines impliquées dans la formation des CDBs et dans la compréhension du substrat du complexe d?initiation. Ce projet regroupe la majorité des activités de notre équipe avec l?investissement de trois chercheurs, deux postdocs, une technicienne, un ou deux étudiants. Les expériences impliquent entre autre plusieurs approches longues par transgènese et sont donc planifiées sur quatre ans.