– Fusogenic lipid

De nombreuses activités cellulaires se basent sur le transport et la fusion vésiculaires. Les protéines SNARE jouent un rôle fondamental dans l?arrimage des vésicules à leur membrane cible. Par contre, les mécanismes de fusion membranaire restent incompris et leur identification représente un défi majeur à relever dans le domaine de la biologie cellulaire. L?originalité de notre projet est de se focaliser sur le rôle des lipides dans la fusion membranaire. Nous avons récemment démontré dans différents processus cellulaire que la fusion membranaire requiert l?apparition de lipides adéquats formés par la phospholipase D (PLD) au point d?apposition des deux membranes. La PLD forme de l?acide phosphatidique (PA) qui peut servir de site de liaison et d?activation pour des protéines fusiogènes ou qui peut créer des courbures membranaires négatives initiant leur fusion. Notre but est d?évaluer la dynamique du PA dans le processus de fusion en étudiant deux types d?évènements cellulaires impliquant des étapes de fusion membranaire, l?exocytose régulée et la phagocytose et de définir les mécanismes de régulation qui gouvernent la synthèse du PA. Notre hypothèse est basée sur le fait qu?une augmentation de l?activité PLD stimule l?exocytose et la phagocytose alors que son extinction bloque ces fonctions. Par ailleurs, la PLD est contrôlée par différentes kinases et GTPases et représente ainsi un candidat idéal pour intégrer les signaux cellulaires au niveau de la fusion membranaire. En utilisant divers modèles de neurones et de cellules endocrines pour étudier l?exocytose régulée et des macrophages pour étudier la phagocytose, nous poursuivrons trois axes de recherche : 1) Nous proposons d?utiliser des domaines de liaison au PA couplé à la GFP pour étudier par microscopie confocale à haute vitesse les cinétiques d?apparition du PA et des sites de fusion. L?intégration de vésicules dans la membrane plasmique et la distribution du PA seront suivies par capacitance, électrophysiologie et ampérométrie, et par une approche ultra-structurale. A échéance, notre but est de corréler la quantité de PA produit par la PLD avec le degré de fusion membranaire. 2) Nous chercherons à définir précisément la composante lipidique des sites de fusion. Par exemple, quelle est nature du PA requis pour générer ou stabiliser les sites de fusion. En d?autres termes, quels sont la longueur et le degré de saturation du PA synthétisé aux sites de fusion. Pour répondre à ces questions, nous purifierons par affinité les domaines riches en PA et étudierons sa composition lipidique par une approche en spectrométrie de masse. Ayant déjà démontré la formation de radeau lipidique de type raft au niveau des sites d?exocytose, nous testerons leur implication dans la séquestration du PA au niveau du site de fusion. 3) Pour comprendre comment une cellule adapte le processus de fusion à ses fonctions et contraintes physiologiques (la fusion peut être un mécanisme extrêmement rapide et asservi au calcium ou un processus chronique défini dans l?espace), nous allons définir le rôle des voies de signalisation qui convergent vers la PLD en utilisant la surexpression de divers mutant, l?extinction par ARN interférence, des modèles transgéniques et la photoinactivation par la technique CALI, avec un intérêt particulier pour les voies de signalisation V-ATPase-ARNO-ARF6 et RSK2. La connaissance précise des voies de régulation qui permettent à une cellule de maîtriser, en lieu et temps, la production de PA pourrait aboutir à l?identification d?agents thérapeutiques visant à corriger des pathologies liées à des défauts du trafic vésiculaire et de fusion membranaire.