– DynaRep

La duplication fidèle des génomes eucaryotes dépend de l?activation séquentielle de multiples origines de réplication distribuées le long des chromosomes. L?activation des origines suit un programme spatio-temporel imposé par le contexte chromosomique et par les checkpoints de phase S. L?exécution correcte de ce programme est essentielle pour le maintien de l?intégrité du génome pendant la réplication de l?ADN. En effet, la progression des fourches de réplication est fréquemment perturbée par des lésions de l?ADN et par des sites naturels de pause. Les fourches de réplication arrêtées sont des structures instables et représentent un danger majeur pour l?intégrité du génome si elles ne sont pas correctement stabilisées puis redémarrées. Le stress réplicatif engendré par ces arrêts de fourche active la voie de signalisation Mec1/ATR dont le rôle est de stabiliser les fourches bloquées et de réprimer l?activation des origines tardives. Le rôle de cette voie a été principalement étudié dans des cellules exposées à des agents génotoxiques. Cependant, le mécanisme par lequel Mec1/ATR régule l?exécution correcte de ce programme reste très mal connu. Le but de ce projet est de fournir une vision génomique de l?exécution du programme de réplication dans des conditions normales de croissance et dans des cellules exposées à des agents génotoxiques. Nous proposons de suivre deux stratégies majeures. Nous déterminerons tout d?abord comment le checkpoint de phase S module l?utilisation des origines et la progression des fourches de réplication chez la levure S. cerevisiae en présence de stress réplicatif. Nous rechercherons ensuite comment ces mécanismes opèrent au cours d?une phase S normale en effectuant des analyses à l?échelle du génome des séquences induisant des arrêts de fourches spontanés chez la levure et dans des cellules humaines. Nous utiliserons une combinaison d?approches génomiques très puissantes (ChIP-on-chip, ChIP-Seq) permettant d?obtenir un profil de réplication global pour une population de cellules ainsi qu?une approche sur des chromosomes uniques (DNA combing) afin d?apprécier la complexité et la variabilité des programmes de réplication d?une cellule à une autre. Dans la première partie de ce projet, nous clarifierons deux aspects importants de la réponse du checkpoint de réplication demeurant mal caractérisés. Le premier aspect concerne le mécanisme par lequel le checkpoint détecte les fourches arrêtées. Nous avons récemment identifié de nouveaux médiateurs de ce checkpoint et proposons de caractériser leur rôle dans l?activation du checkpoint de réplication. Nous caractériserons également une éventuelle contribution du checkpoint de DNA damage dans la régulation du timing de réplication. La seconde question majeure de cette première partie est de comprendre comment le checkpoint de réplication régule la vitesse de progression des fourches de réplication, une question encore soumise à controverse. Nous analyserons les vitesses de progression des fourches de réplication en présence ou absence de stress réplicatif. Un aspect important dans cette partie du projet concerne l?analyse des pools cellulaires de nucléotides dont la disponibilité apparaît comme étant finement régulée pendant la phase S et en réponse à l?activation du checkpoint. Après avoir approfondi les mécanismes de gestion des fourches endommagées par le stress réplicatif, nous proposons dans une seconde partie de déterminer si les checkpoints de phase S contribuent à l?exécution correcte du programme de réplication et au maintien de la stabilité du génome au cours d?une phase S normale. En effet, des arrêts de fourches de réplication peuvent également se produire spontanément au cours d?une phase S normale lorsque la fourche rencontre des complexes protéiques fortement associés à l?ADN ou des structures particulières d?ADN difficiles à répliquer. Dans un premier temps, afin d?identifier des régions intrinsèquement difficiles à répliquer nous cartographierons à l?échelle du génome les marques ?-H2A(X), un variant d?histone H2A phosphorylé marqueur de cassures double brins. Nous rechercherons ensuite un lien éventuel de ces régions avec des régions connues pour présenter une interférence avec la réplication, comme les R-loops émanant de la transcription. Dans un second temps, nous transposerons cette analyse dans des cellules humaines car des données récentes indiquent que les étapes précoces du processus de cancérisation sont associées à un stress réplicatif engendrant des cassures double brin de l?ADN. Nous cartographierons ces sites de cassures gamma-H2A(X) dans des lignées surexprimant différents oncogènes afin de déterminer comment cette surexpression peut créer un stress de réplication et générer de l?instabilité génomique. La caractérisation de ces stress réplicatifs représentent un aspect essentiel pour la compréhension des stades précoces de la tumorigénèse.