– CDKDNA

La régulation de la prolifération cellulaire constitue l'un des contrôles les plus fondamentaux de la biologie. Un contrôle défaillant génère des pathologies graves, dont les cancers. Si nous pouvions restaurer une régulation normale de la prolifération cellulaire, nous pourrions alors éradiquer ces maladies. Dans tous les eucaryotes, ce contrôle est assuré par les kinases dépendantes de cyclines (CDK), une découverte dont l'importance fût reconnue par l'attribution du prix Nobel en médecine en 2001. Il pourrait alors paraître surprenant qu'en 2008, les fonctions des Cdks demeurent mal comprises au niveau moléculaire. Notre ignorance des substrats des Cdks et les rôles des phosphorylations de ces substrats reste un problème majeur, auquel se rajoute la redondance fonctionnelle entre différentes Cdks. Par exemple, pour initier la réplication de l'ADN, l'activation des Cdks est nécessaire, mais les rôles des différents Cdks, et les substrats impliqués dans cette transition, sont largement inconnus. Dans ce projet, nous associons deux systèmes modèles, le modèle biochimique des extraits d'oeufs de Xénope, et celui de la génétique des vertébrés des cellules DT40, ce qui devrait nous permettre de découvrir des fonctions importantes, car conservées. En appliquant les technologies récentes de la génétique-chimique et de la phosphoprotéomique à ces systèmes, nous espérons mettre en évidence des nouveaux substrats physiologiques de Cdks, et mieux comprendre les rôles respectifs des différentes Cdks. Nous proposons que les phosphorylations essentielles par des Cdks vont avoir lieu sur la chromatine. Dans un premier temps, nous vérifierons cette notion par des expériences de transfert de la chromatine dans les extraits d'oeufs de Xénope. Nous attendons à ce qu'un nombre limité de phosphorylations suffiront pour charger des complexes d'initiation de la réplication sur la chromatine. Si ceci se révélait vrai, nous pourrions imaginer de contourner les Cdks pour initier la réplication, en manipulant des substrats de Cdks dans les extraits de Xénope ou par la génétique dans des cellules DT40. Un tel résultat serait d'une grande importance. Cependant, il est envisageable que les Cdks seraient également requises pour remodeler la chromatine, pour la rendre compétente à répliquer. Dans ce cas, encore, l'usage des extraits de Xénope devrait nous permettre de mettre en évidence ces étapes séquentielles dépendantes des Cdks. Ensuite, nous utiliserons une combinaison d'approches nouvelles, basées sur la protéomique, pour identifier des substrats physiologiques des Cdks dont la phosphorylation est requise pour initier la réplication. Les fonctions de ceux-ci seront étudiées par des approches de biochimie et de génétique. Pour l'étude fonctionnelle des Cdks, notamment les contributions respectives de Cdk1 et de Cdk2 au maintien de la stabilité génomique, nous mettrons en oeuvre une approche nouvelle basée sur un by-pass génétique d'une inhibition chimique. Dans cette approche, nous inhibons chimiquement les Cdks, et nous restaurons l'activité de l'une d'entre elles via des allèles résistantes à l'inhibiteur (allèles ir), conçus grâce à la modélisation moléculaire et la bioinformatique. L'utilisation des Cdks-ir nous permettra d'éviter les mises en garde habituelles lors des interprétations de phénotypes d'inhibition chimique. En même temps, ces outils fourniront des informations importantes sur la spécificité des inhibiteurs de Cdks, et sur le développement éventuel de résistance cellulaire contre l'inhibiteur via la mutation de la kinase cible. Nous avons déjà entrepris une étude de preuve de concept, et nous voulons maintenant développer cette approche. Nous avons récemment démontré que la diminution de l'activité Cdk à des niveaux faibles conduit à une diminution conséquente d'évènements d'initiation de la réplication; ceci devrait, à son tour, mener à une réplication incomplète car impossibilité de compenser pour une fourche de réplication effondrée, et provoquer une instabilité génomique. À ce titre, nous utiliserons des inhibiteurs de Cdk1 et Cdk2, associés aux allèles ir des deux Cdks, pour analyser l'implication de chaque Cdk dans la stabilité génomique via le contrôle de l'activation des origines de réplication. Par ailleurs, Cdk2 joue des rôles clés dans la duplication des centrosomes et dans l'entrée en mitose, même si les contributions respectives de Cdk1 et de Cdk2 à cette transition ne sont pas encore comprises. Il est néanmoins probable que l'inhibition des Cdks va perturber la progression normale à travers la mitose, et ainsi contribuer à une instabilité du génome. Avec nos Cdks-ir, nous allons donc également étudier les contributions de Cdk1 et de Cdk2 à la stabilité génomique via leur contrôle de la progression à travers la mitose. Ces expériences seront conduites à la fois dans les extraits d'oeufs de Xénope et dans les cellules DT40.