– DNA GATING

Comprendre les principes qui régissent l'assemblage macromoléculaire est aujourd?hui un défi pour les biologistes. L?assemblage des virus bactériens est un système tout à fait approprié pour l?étude des mécanismes moléculaires à la base de la formation d'une machinerie macromoléculaire et de sa fonction. Un grand nombre de phages et de virus eucaryotes utilisent un système portal pour contrôler l'entrée du génome et sa sortie de la capside. Ils font entrer l'ADN viral par le canal central de leur protéine portale jusqu?à leur procapside. La fin de l?encapsidation est coordonnée avec la fermeture du canal, normalement obtenu par la liaison des protéines de complétion de la tête. Les protéines portale et de complétion forment le connecteur tête-queue du virus. Le canal de ce complexe ouvre ses portes au début de l?infection de la cellule hôte afin de permettre l'éjection de l?ADN des particules de phage au cytoplasme de la cellule hôte. La structure pseudo-atomique du connecteur fermé complet du bactériophage à queue SPP1 a été déterminée. L?ouverture du connecteur et l'éjection de l'ADN à partir de virions a été reproduite in vitro en ajoutant le récepteur YueB de l?hôte purifié. Ces réalisations font de SPP1 un excellent système pour étudier l'organisation structurale et la dynamique d?un complexe protéique gardien d?un ADN viral. Notre projet de recherche regroupe une équipe spécialisée dans l'assemblage des bactériophages et une autre avec une expertise en RMN des protéines et modélisation moléculaire. Il est basé sur une approche interdisciplinaire et a pour but de caractériser les mécanismes moléculaires de l'assemblage et de la fonction du connecteur du bactériophage SPP1 : 1. Assemblage du connecteur de SPP1 : définir le programme de changements conformationnels subis par les protéines du connecteur au cours de l?assemblage de ce complexe. Les interfaces d'interaction entre sous-unités au sein de la structure du connecteur seront définies de manière détaillée en utilisant la RMN en phase liquide et solide, la modélisation moléculaire, la biochimie et la génétique. La comparaison des structures tridimensionnelles des protéines du connecteur sous formes isolées et assemblées fournira un aperçu moléculaire des remaniements structuraux nécessaires à l'assemblage. Des expériences spectroscopiques et biochimiques seront utilisées pour sonder ces changements conformationnels lors de réactions d?assemblage du connecteur reconstituées in vitro. 2. Attachement de la queue au connecteur fermé : comprendre si la liaison de la queue au connecteur au cours de l'assemblage viral cause des changements structuraux dans le connecteur pour faciliter la sortie de l?ADN. Cette étape de l?assemblage sera reproduite in vitro en utilisant des capsides pleines d?ADN comprenant le connecteur, des queues et gp17, une protéine de SPP1 qui est nécessaire à l?attachement du connecteur à la queue. La structure de gp17 sera déterminée par RMN. Des reconstructions tridimensionnelles issues de la cryo-microscopie sur le connecteur isolé et sur l?interface entre le connecteur et la queue seront utilisées pour positionner les structures atomiques des protéines individuelles. La comparaison des modèles résultants mettra en évidence les changements conformationnels associés à la liaison du connecteur à la queue. 3. Mécanisme d'ouverture du connecteur : caractérisation des événements qui conduisent à l'ouverture du connecteur au début de l'infection et de leur coordination avec l?éjection de l?ADN. Les sous-unités adjacentes de la protéine gp16 du connecteur ont été reliées de manière covalente par des ponts disulfure introduits à l'intérieur du feuillet ? fermant le canal portal. Ces pontages ont conduit à l'inhibition réversible de l?éjection de l?ADN. Nous allons maintenant imaginer de nouveaux mutants pour aller plus loin dans la compréhension des changements de conformation impliqués dans l'ouverture du canal du connecteur. Un modèle pseudo-atomique de l?interface queue-connecteur ouvert sera calculé en positionnant les structures des protéines isolées dans les reconstructions tridimensionnelles issues de la cryo-microscopie. Il fournira l?image finale du film des états conformationnels du connecteur détaillés dans cette étude. Un effort important sera consacré à établir un protocole utilisant le FRET pour suivre le passage de l?état fermé à l?état ouvert du connecteur. Les études génétiques et biochimiques proposées seront complétées par le suivi de la libération de l?ADN par les particules virales pour corréler l?ouverture du connecteur avec la sortie de l?ADN. Les résultats obtenus devraient permettre une avancée significative dans notre compréhension des mécanismes de séquestration et de libération de l'ADN par les particules virales. Ces travaux sont également un moyen efficace de tester une méthodologie interdisciplinaire pour l?étude structurale et fonctionnelle d?un assemblage macromoléculaire.