Remodelage de la chromatine par des nano moteurs dépendants d’ATP et réparation de bases de l’ADN – CROREMBER

Dans les cellules eucaryotes l'ADN est compactée sous forme de chromatine. Pour surmonter la structure répressive des nucléosomes, les cellules utilisent des facteurs de remodelage da la chromatine. Leur rôle crucial a été souligné aussi par des expériences de génétique in vivo, dans la levure, Drosophila, C. elegans et dans des eucaryotes supérieurs. Ces moteurs moléculaires sont capables de dissocier les interactions ADN-histones via l'hydrolyse de l'ATP. Ce sont des complexes multi protéiques, contenants tous une sous unité ATPase dédiée et plusieurs autres (jusqu'à 14-16) sous unités. Tous les remodelers peuvent faciliter le « glissement » du nucléosome en cis. En outre, les remodelers de la famille SWI/SNF sont capables de dissocier les interactions ADN-histone plus extensivement de façon que l'octamer soit éjecté de l'ADN. Malgré les efforts considérables aussi bien les mécanismes d'action des facteurs de remodelage que les conformations des nucleosomes remodelés restent largement inconnues; l'activité translocase des remodelers étant la seule proprement établie. Les donnés de la littérature montrent aussi que la mobilisation du nucléosome est directionnelle. Toutefois, l'origine de cette polarité dans des particules symétriques reste obscure. Finalement, il est intéressent aussi d?établir pourquoi les nucléosomes variantes mH2A et H2A.Bbd restent réfractaires au remodelage ainsi que quel est l?origine de l?effet co-remodelage de la nucléoline que nous avons récemment mis évidence. Dans ce projet nous proposons d?étudier les transitions structurales du nucléosome induites par les facteurs de remodelage de la chromatine SWI/SNF, RSC, ISWI et ACF. En particulier, notre attention sera focalisée sur les mécanismes de l?action des remodelers de la chromatine ainsi que la dynamique de leur action. Nous proposons aussi de comprendre pourquoi et de quelle façon certains nucléosomes variants (macroH2A, H2A.Bbd) empêchent le fonctionnement de ces complexes. Finalement, nous proposons d?adresser le mécanisme de l?effet « amplificateur » de la nucléoline ainsi que d?identifier d?autres protéines de co-remodelage de la chromatine, possédantes une activité de chaperonne d?histones. L?ADN génomique est constamment soumise aux dommages oxydatifs causés par un ensemble de facteurs endogènes et exogènes. L?accumulation de ces lésions d?ADN peut mener à une instabilité du génome et le développement de cancers. La fonction de « gardien » du génome est assurée par les mécanismes de réparation, en particulier par excision des bases (BER). Alors que des connaissances importantes de ces mécanismes dans le cas d?ADN nue ont été acquises, mais ils existent très peux de donnes sur la réparation BER dans le contexte de chromatine. Dans ce projet, nous proposons d?étudier l?effet de la dynamique et de la structure de la chromatine sur la réparation des lésions d?oxydations d?ADN (simples et en tandem) par la voie BER. Les effets de la présence de variants d?histones, tels que mH2A, H2ABbd et H2AX, de l?histone de liaison H1, de différent chaperonnes d?histones ainsi que des facteurs de remodelage dépendant d?ATP seront adressées. Nous allons reconstituer in vitro une nouvelle matrice chromatinienne de nucleosomes parfaitement positionnés, contenant une lésion unique a des endroits spécifiques dans l?ADN de liaison ou à l?intérieur d?un nucleosome. L?étude des différents étapes du BER sera menée avec l?utilisation des facteurs recombinant et des extraite cellulaires à l?aide d?une combinaison de méthodes de physique et de biologie moléculaire a pointe. En particulier, l?application de la méthode de pontage et empreinte par laser UV que nous avons développée nous permettra de « visualiser » la dynamique d?interaction protéine-ADN, avec une résolution dans le temps milliseconde et dans l?espace une base nucléique, ce qui nous aidera à comprendre comment un enzyme BER reconnaît et traite la lésion dans une matrice physiologique. C?est un projet pluridisciplinaire, ou nous utiliserons une combinaison originale d?approches de la physique et de la biologie moléculaire à pointe, pour l?étude de problèmes biologiques « chauds » et importants. Nous espérons donner réponse à certains caractéristiques fondamentales de la dynamique et le remodelage de la chromatine et de la BER in vitro, en particulier comment ce système reconnaît et répare une lésion d?oxydation dans la chromatine.