Etude des Régulations Post-traductionnelles du Transporteur Racinaire de NO3- NRT2.1 – TransN

L?azote (N) est un élément minéral essentiel pour les plantes qui, la plupart du temps, est limitant pour la croissance et le rendement, ce qui entraine un usage massif d?engrais en agriculture. Au cours des dix dernières années, les bases moléculaires du transport racinaire de NO3- ont fait l?objet d?intenses recherches. Un des principaux résultats a été l?identification, chez Arabidopsis, de NRT2.1 comme composante majeure du système de transport de NO3- à forte affinité (HATS). De plus, il a été montré que NRT2.1, en plus de son rôle dans le transport de NO3-, agit également comme senseur dans la réponse de la croissance des racines latérales à NO3-. La régulation de NRT2.1 a été largement étudiée ce qui a permis de montrer qu?il existe une forte corrélation entre le niveau d?expression de NRT2.1 et l?activité du HATS. Cependant, malgré son rôle central dans la nutrition des plantes, les connaissances concernant les mécanismes de régulation impliqués ont été obtenues au niveau des ARNm, comme c?est le cas pour la plupart des transporteurs d?ions racinaires. A cause des problèmes techniques associés à l?étude des protéines membranaires, il y a beaucoup moins d?informations disponibles concernant la régulation de NRT2.1 au niveau protéique. Jusqu?à présent, les seules données disponibles ont été publiées par le coordinateur de ce projet. Ce travail indique que (i) NRT2.1 fait partie d?un complexe de haut poids moléculaire (~120 kD) qui coexiste avec la forme monomérique (~45 kDa) dans la membrane plasmique, (ii) l?abondance de la protéine NRT2.1 dans la membrane plasmique est faiblement affectée par les facteurs environnementaux qui modulent à la fois le niveau d?ARNm et l?activité du HATS et (iii) il y a des éléments qui montrent qu?il existe une protéolyse partielle de NRT2.1 dans la partie C-terminale de la protéine. Le projet présenté vise à tirer partie des nouveaux outils développés en biochimie et en protéomique pour élucider les mécanismes impliqués dans le contrôle post-traductionnel de NRT2.1. Nous proposons une approche systématique dont les buts sont : (i) d?identifier les protéines qui interagissent avec NRT2.1, (ii) de déterminer le site et le rôle du clivage de la partie C-terminale de NRT2.1 et (iii) de déterminer si NRT2.1 est phosphorylé en réponse à des signaux environnementaux comme le niveau de la photosynthèse et la disponibilité en N. Ceci nous permettra de révéler la nature précise des différentes formes de NRT2.1 et de les manipuler de manière indépendante pour rechercher leur fonction spécifique dans le transport de NO3- et la croissance racinaire. De plus, l?identification de modifications post-traductionnelles affectant NRT2.1 dans la membrane plasmique (clivage en C-terminal, phosphorylation) nous apportera des réponses sur les mécanismes de régulations responsables des changements rapides de l?activité de ce système de transport en réponse aux facteurs environnementaux. Ce travail sera réalisé dans le contexte d?une collaboration entre le groupe du Dr. Alain Gojon (partenaire 1) dans le laboratoire de Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes à Montpellier et le groupe du Dr. Michel Rossignol (partenaire 2) dans le laboratoire de Protéomique fonctionnelle à Montpellier. Ces deux groupes sont des leaders dans respectivement les domaines du transport de NO3- et la protéomique, et le but est de combiner leurs compétences. Le partenaire 2 sera impliqué dans (i) l?utilisation de GC/MS MS, LC/MS MS et MALDI TOF pour rechercher les modifications post-traductionnelles, comme les phosphorylations, en utilisant les protocoles que ce partenaire a développé pour leur plateforme de protéomique et (ii) le développement de méthodes comme le Blue native PAGE pour étudier les interactions protéine-protéine, ou de stratégies pour séquencer la partie C-terminale de NRT2.1 est déterminer le site de clivage. Les résultats de ces approches seront utilisés par le partenaire 1 pour caractériser au niveau fonctionnel l?impact des modifications post-traductionnelles mises en évidence sur l?activité du système de transport NRT2.1 en réponse aux facteurs environnementaux. Ceci impliquera le développement d?un protocole de transformation transitoire des racines d?Arabidopsis thaliana ainsi que l?utilisation des ovocytes de Xénope. Nous pensons qu?en combinant nos efforts nous pourrons décrypter les mécanismes qui contrôlent la voie majeure de l?entrée de N dans la plante.