Biogenèse de la poche flagellaire , caractérisation de l’organelle d’endo-exocytose chez Trypanosoma brucei. – Bio-Pocket

Trypanosoma brucei est un parasite protozoaire flagellé qui est utilisé comme système modèle pour l?étude de processus biologiques comme l?expression de genes, le traffic protéique et la biogenèse du cytosquelette. Chez T. brucei et les parasites apparentés, l?endo- et l?exocytose a lieu uniquement au niveau d?un organelle spécialisé, la poche flagellaire (PF), qui est formée par une invagination de la membrane plasmique. Pour mieux comprendre la biogenèse du flagelle et du cytosquelette en général, nos études se sont focalisées sur l?analyse immunologique et protéomique des protéines mineures du flagelle de T. brucei. Parmi les anticorps monoclonaux que nous avons produits contre ces protéines, l?un d?entre eux reconnaît une structure insoluble à l?entrée de la poche flagellaire appelée le cou de la PF (CPF) où le flagelle émerge de la cellule. En utilisant des westerns blot de gels 2D et la spectrométrie de masse, nous avons découvert une nouvelle protéine, BILBO1, qui est le premier composant cytosquelettique de la poche flagellaire identifié chez T. brucei (et parasites apparentés) et qui appartient à la CPF. L?organisation structurale de certains cils primaires est très similaire à celle du flagelle de trypanosome. En particulier, ces cils primaires présentent une structure en poche où des évènements d?endocytose ont été mis en évidence. Cependant, le rôle de l?endocytose n?est pas connu et aucun composant moléculaire qui maintient la poche n?a encore été identifié. L?extinction de l?expression de BILBO1 par ARNi inductible dans les formes insecte et sanguines de T. brucei induit un blocage de la cytokinèse après 24hr. Le phénotype dominant apparaît après 36hr d?induction. Les cellules s ?accumulent au stade pre-cytokinèse mais surtout la biogenèse de la PF est inhibée. Nous avons récemment identifié une seconde protéine appelée BILBO2. La production d?un anticorps dirigé contre BILBO2 nous a permis de la localiser au niveau de la structure CPF. Nous sommes le premier et l?unique laboratoire ayant identifié des protéines structurales de la poche flagellaire. Dans le projet proposé, nous cherchons a comprendre les processus de biogenèse et de fonction de la poche flagellaire en répondant aux questions suivantes : a). Pourquoi la structure CPF est essentielle? b). Quels sont les partenaires de BILBO1/2 et leurs interactions peuvent-elles être bloquées ? c). BILBO1/2, ou leurs partenaires, sont-elles exposées à la lumière de la poche flagellaire et donc accessibles pour des anticorps? La recherche de partenaires de BILBO1/2 est importante car nous identifierons probablement des protéines avec des homologues dans des génomes d?autres organismes notamment de l?homme. De ce point de vue, nos travaux et résultats seront attractifs pour l?identification d?homologues structuraux de BILBO1/BILBO2 pour comprendre l?organisation et le positionnement de flagelles et de cils de mammifères (i.e. maladies liées aux défauts des cils primaires et des cils et flagelles). Pour répondre aux questions posées nous ; 1) caractériserons l?interaction potentielle de BILBO1 avec elle-même ainsi qu?avec BILBO2 via la technology AlphaScreen®, 2) identifierons, par la technique du double hybride et de pontage chimique, et caractériserons les partenaires de BILBO1/2, 3) nous analyserons la biogenèse de la PF en visualisant des formes étiquettées de BILBO1/2 et en analysant leur rôle dans la biogenèse, la division et le recyclage de la PF, 4) analyserons la fonction précise de BILBO2 par ARNi, étiquettage et expression de domaines in vivo chez les formes insecte et sanguine, 5) identifierons les domaines des protéines de la CPF exposés vers le lumen de la PF en incubant les cellules vivantes avec des fragments FAB purifiés dirigés contre ces protéines. L?analyse de la biogenèse de la PF présente un fort potentiel d?applications dans le domaine de la parasitologie médicale et vétérinaire puisqu?une seule protéine joue un rôle essentiel dans cette biogenèse. Ceci est important car trois fonctions essentielles de la PF sont inhibées en absence de cet organel : le parasite devient visible et exposé au système immunitaire, incapable d?éliminer les anticorps de l?hôte et incapable d?effectuer l?endo- et l?exocytose. BILBO1 et BILBO2 représentent donc deux cibles thérapeutiques de choix pour de nouvelles drogues brevetables. De plus, nous serons capable de définir comment la PF est formée et translater ces données aux cils primaires et de tester si la poche de ces cils est formée de manière similaire à la PF. Enfin, nous pourrons identifier des rôles potentiels de la poche dans les maladies liées aux défauts de structure ou fonction des cils.