Relation structure-état nucléotidique-capacité à s’assembler : la tubuline dans tous ses états. – Mec-Tub

Les microtubules sont des structures dynamiques du cytosquelette eucaryote impliquées dans des fonctions aussi diverses que le trafic cellulaire ou la mitose. Ils alternent de façon stochastique entre des phases de croissance lente et des phases de dépolymérisation rapide selon un processus dit d?instabilité dynamique. L?élément de base des microtubules est la tubuline, une protéine hétérodimérique abondante dans la cellule. L?assemblage des microtubules est lié à la nature du nucléotide fixé à la sous-unité ? de la tubuline. Dans les conditions physiologiques, seule la tubuline-GTP s?assemble en microtubules, ce qui s?accompagne de l?hydrolyse du GTP. Les microtubules sont ainsi constitués majoritairement de tubuline-GDP, qui ne peut s?assembler par elle-même. Lors de la dépolymérisation, la tubuline libérée doit échanger son GDP pour du GTP pour participer à un nouveau cycle. Si le cycle d?assemblage-désassemblage de la tubuline lié à son cycle nucléotidique est bien décrit, le cycle structural sous-jacent n?est qu?en partie connu. Seuls deux types de structures de tubuline-GDP sont disponibles, à des résolutions de 3,5 Å environ. Ils correspondent à la tubuline incorporée dans le microtubule et après désassemblage. Par contre nous ne connaissons pas la structure de la tubuline-GTP avant polymérisation. Notre projet se propose d?identifier les changements structuraux induits par la fixation du GTP et qui rendent la tubuline compétente pour l?assemblage. Il implique de déterminer la structure de la tubuline-GTP, à une résolution suffisante pour identifier avec confiance les changements de structure liés à la nature du nucléotide. Une amélioration du pouvoir diffractant des cristaux est donc également requise. La tubuline a longtemps résisté aux efforts des structuralistes pour obtenir des cristaux exploitables, en particulier parce que c?est une protéine instable qui a une forte propension à s?assembler en oligomères hétérogènes. Les seuls cristaux obtenus à ce jour sont des cristaux de tubuline stabilisée. Nous proposons de développer de nouveaux outils pour stabiliser la tubuline à l?échelle de temps de la cristallisation et nous explorerons à cet effet plusieurs voies, en parallèle. Pour chaque nouvelle entité de tubuline obtenue, des essais de cristallisation en présence de GDP et de GTP ou d?un analogue stable seront entrepris. Nous développerons tout d?abord des approches à partir de séquestrants connus de la tubuline. Ainsi nous introduirons des mutations dans le domaine stathmine pour renforcer son interaction avec la tubuline, et nous synthétiserons des peptides de stathmine pouvant se fixer de façon covalente à la tubuline et empêcher son assemblage. Nous avons récemment caractérisé un autre séquestrant qui se fixe à la tubuline et prévient son auto-assemblage, il s?agit du domaine PN2-3 de la protéine centrosomale CPAP. Les essais de cristallisation de ce domaine en complexe avec la tubuline n?ont pour l?instant pas abouti. Nous proposons de construire un domaine CPAP qui englobe non seulement PN2-3 mais également la région en aval qui se fixe aux microtubules. Nous poursuivrons également l?étude en cours au laboratoire de la cartographie de l?interaction tubuline:PN2-3. Le cas échéant, nous concevrons des chimères domaine stathmine:PN2-3 récapitulant les propriétés des protéines isolées. Enfin, et toujours sur la base de nos résultats récents, nous testerons l?effet de modifications sur des molécules du domaine vinca, afin de convertir ces promoteurs d?assemblages de tubuline en séquestrants. Ces approches nous procureront des entités de tubuline bien différentes pour la cristallisation. Deux voies seront explorées en vue de la diversification supplémentaire de ces entités. Nous proposons de sélectionner des protéines de type "ankyrine repeat" (ou DARPins) qui se lient à la tubuline afin d?en modifier la surface et donc les propriétés de cristallisation. Nous avons noté également une influence des ligands exogènes pour la cristallisation de complexes tubuline-domaine stathmine, en particulier ceux qui se fixent au site vinca. Nous proposons de cribler des chimiothèques, en commençant par celle de l?ICSN riche quelque 4400 composés, pour identifier de nouveaux ligands de la tubuline. La priorité sera donnée à ceux qui ciblent le site vinca et qui sont de formule plus simple que les ligands disponibles aujourd?hui, mais aussi à ceux se lient à un site non encore décrit de la tubuline. Ce projet a des retombées potentielles au-delà de son objectif premier. Ainsi tout nouvel agent stabilisant sera utile pour l?étude de la tubuline en général, notamment en biochimie et en biologie structurale. De même la découverte de nouveaux inhibiteurs pourra servir de base pour le développement de nouveaux médicaments ciblant les microtubules, en particulier dans le domaine de l?oncologie.