Biologie moléculaire structurale et cellulaire intégrée de l'assemblage du facteur de transcription général TFIID – TFIID-COMPLEXES

Ce projet a pour objectif de comprendre l?organisation supramoléculaire du facteur de transcription TFIID humain afin de répondre aux questions biologiques liées à l?initiation de la transcription des gènes chez les eucaryotes. Nous mettrons en ?uvre des approches biochimiques, biophysiques et de biologie cellulaire pour produire et caractériser des formes endogènes et recombinantes de TFIID identifiées in vivo comme des intermédiaires d?assemblage. Notre projet comprend les points suivants: (1) Nous souhaitons résoudre la structure atomique de TAF2, un composant majeur du complexe TFIID, participant à la reconnaissance du promoteur des gènes. Un fragment stable de 110 kDa de TAF2 a été identifié et produit en vue d?essais de cristallisation pour résoudre sa structure. TAF2 sera également caractérisé par des méthodes biochimiques afin d?étudier son implication dans la reconnaissance de la chromatine épigénétiquement modifiée. Enfin, TAF2 sera localisé dans le complexe endogène en positionnant la structure atomique dans une enveloppe de TFIID de levure dont la résolution actuelle de 18 Å sera améliorée par cryomicroscopie électronique. (2) SMAT, un petit complexe de 400 kDa contenant plusieurs sous-unités de TFIID a été récemment mis en évidence in vivo comme l?élément central des voies d?assemblage menant à deux complexes distincts mais qui comportent quelques sous-unités en commun : TFIID et SAGA. SMAT sera produit, caractérisé et des essais de cristallisation seront entrepris pour résoudre sa structure atomique. Son architecture minimale sera identifiée par une nouvelle technique associant la protéolyse et la spectrométrie de masse. (3) Des mutations ponctuelles seront introduites dans les différents composants de SMAT (TAF10, TAF8 et SPT7L) afin d?identifier les sites affectant l?intégrité du complexe. Des lignées cellulaires stables exprimant ces mutants seront générées et dans lesquelles l?expression des copies endogènes sera réprimée par ARN interférence. Ce système nous permettra d?aborder les mécanismes cellulaires gouvernant la spécificité d?incorporation de TAF10-TAF8 dans TFIID et de TAF10-SPT7L dans SAGA. (4) Par une approche de bioingénierie, des sous-complexes physiologiques de TFIID humain seront produits avec une qualité compatible avec les études structurales. Des résultats préliminaires montrent qu?un sous-complexe stable comportant 7 sous-unités peut être généré sous forme recombinante. Après production à grande échelle de ce sous-complexe, sa structure sera résolue à l?échelle moléculaire par cryomicroscopie électronique et/ou atomique par cristallographie. (5) Grace aux améliorations de notre technologie de production de complexes multiprotéiques recombinant, nous ambitionnons de produire à grande échelle un complexe TFIID complet, homogène et pleinement fonctionnel. Récemment, la dernière sous-unité manquante de TFIID, TAF3, a été clonée et nous testerons son rôle dans l?assemblage de TFIID. La production d?un complexe homogène aura une incidence directe sur la résolution des enveloppes obtenues par microscopie électronique et nous permettra, en comparant tous les complexes recombinants, de positionner précisément les sous-unités de TFIID. Par ailleurs l?accès à un complexe fonctionnel recombinant nous permettra de générer des complexes mutants pour tester des hypothèses fonctionnelles. (6) Les modifications post transcriptionnelles (MPT) des sous-unités de TFIID peuvent jouer un rôle important dans la fonction et l?assemblage du complexe. Nous souhaitons utiliser les techniques MS-MS de protéomique de haute précision pour analyser les MPT des complexes recombinants et du TFIID humain endogène afin de préciser le rôle de ces modifications. Au cas où elles s?avèreraient importante pour l?assemblage de TFIID, ces MPT pourront être mimées par des mutations dans les vecteurs d?expression correspondants. (7) Afin de mieux comprendre les mécanismes d?assemblages in vivo, nous souhaitons visualiser le mécanisme de translocation et d?assemblage des sous-unités spécifiquement étiquetées avec une protéine fluorescente (FP tag). Des lignées stables des cellules HeLa exprimant les sous-unités fluorescentes seront produites. Des vecteurs d?expression pour plusieurs sous-unités de TFIID ont déjà été générés et la construction de ces vecteurs sera étendue à toutes les sous-unités ainsi qu?à TBP. Ce projet interdisciplinaire nous permettra de mieux comprendre la structure et le mécanisme d?assemblage du complexe TFIID. En outre, il permettra de développer et de valider des technologies innovantes de production de grands complexes multiprotéiques recombinants qui seront à l?avenir des outils indispensables pour l?étude structurale et fonctionnelle des grandes acitivités biologiques de la cellule.