Les rôles physiologiques des Ser/Thr protéine kinases essentielles PknA et PknB chez les mycobacteries – TBKIN

Mycobacterium tuberculosis est l'agent étiologique responsable de la tuberculose, une maladie infectieuse qui a profondément influencé le cours de l'évolution humaine et reste toujours un problème majeur de santé publique. Pour alterner entre la division cellulaire active et les états non réplicatifs, le bacille utilise plusieurs molécules de signalisation pour répondre à des signaux dans son environnement, et ces systèmes dépendent largement de la phosphorylation réversible de protéines. Le génome de M. tuberculosis contient plusieurs gènes codant pour des Ser/Thr protéine kinases de type eucaryote, et deux de ces gènes (pknA et pknB) sont essentiels pour la croissance des mycobactéries. Notre objectif à long terme est de comprendre comment les mycobactéries utilisent la phosphorylation en résidus Ser/Thr pour contrôler des processus physiologiques essentiels en réponse aux signaux extérieurs.Les Ser/Thr protéine kinases et phosphatases mycobactériennes jouent un rôle important dans les interactions hôte-parasite. Chez M. tuberculosis, ces enzymes contrôlent non seulement des processus physiologiques essentiels, mais elles participent aussi à la subversion des voies de signalisation de la cellule hôte. Dans ce projet, nous proposons l’utilisation des approches biochimiques, biophysiques, génétiques et de l’ingénierie de protéines pour étudier les rôles de deux Ser/Thr protéine kinases, PknA et PnkB, chez les mycobactéries. Les objectifs spécifiques du projet sont de caractériser la nature des signaux extracellulaires qui activent les kinases, les mécanismes de régulation de cette activité, et le rôle de GarA (un substrat optimal de PknB) dans le métabolisme des mycobactéries. Ainsi, nous effectuerons l’analyse structurale et biochimique du domaine extracellulaire de PknB impliqué dans la reconnaissance des signaux, et produirons des souches de M. smegmatis portant des mutations dans ce domaine pour valider les hypothèses fonctionnelles. En outre, la méthode de `ribosomal display’ sera utilisée pour produire des protéines capables de fixer spécifiquement ce domaine, afin d’étudier leur possible effet agoniste ou antagoniste. Pour comprendre les mécanismes de régulation des domaines catalytiques de PknA et PknB, nous réaliserons l’analyse structurale des protéines recombinantes et étudierons leurs propriétés de homo- et hétéro-dimérisation in vitro et in vivo. Par ailleurs, des mutants conditionnels des gènes pknA et pknB seront réalisés chez M. smegmatis (et éventuellement chez M. tuberculosis) pour tester les hypothèses mécanistiques issues de l’analyse structurale. Finalement, nous étudierons les propriétés moléculaires et fonctionnelles de GarA, un substrat optimale de PknB, et leurs interactions avec ses partenaires biologiques pour tenter de comprendre le rôle physiologique de la protéine et son implication dans les voies de signalisation chez les my Les résultats attendus du projet contribueront à comprendre les rôles biologiques et les mécanismes sous-jacents des Ser/Thr protéine kinases dans le contrôle du métabolisme mycobacterien dans les différents étapes du cycle cellulaire. En particulier, nous espérons que le projet de recherche proposée produise des informations importantes sur les bases moléculaires de la reconnaissance de signaux, des mécanismes de transduction à travers de la membrane cellulaire et des mécanismes de régulation des kinases mycobacteriennes. Par ailleurs, les études in vitro et in vivo du substrat GarA devront aider à l'identification de nouvelles voies de signalisation contrôlées par des Ser/Thr protéine kinases chez les mycobacteries. En outre, le caractère essentiel de PknA et PknB suggère que la réalisation du projet devrait avoir un impact dans l'identification et la caractérisation de nouvelles cibles pour l'intervention thérapeutique contre la tuberculose.