Composants de la cellule hôte conférant la sensibilité à l'injection de toxines par le système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa. – myalo-pseudo

La bactérie Pseudomonas aeruginosa est responsable d'infections nosocomiales et cause de mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose. Comme d'autres bactéries Gram négatives, P. aeruginosa injecte des toxines dans les cellules grâce à une nano-machinerie complexe, le système de sécrétion de type III (SST3), qui est induite par contact avec la cellule hôte. Les éléments cellulaires nécessaires à l'induction ou à l'insertion du translocon du SST3 dans la membrane de l'hôte ne sont pas connus. L'identification d'une lignée myeloïde (HL-60) résistante au SST3, mais dont on peut induire la sensibilité, offre un modèle pertinent pour étudier les facteurs cellulaires influençant l'établissement d'un SST3 fonctionnel et identifier les composants nécessaires à l'insertion du translocon dans la membrane plasmique de l'hôte. Du fait de l'émergence de souches multi-résistantes aux antibiotiques, ces éléments représenteraient de nouvelles cibles pour développer des thérapies innovantes.Un système rapporteur de l'injection SST3-dépendant, basé sur une fusion entre une toxine et la bêta-lactamase, sera utilisé. La translocation sera détectée grâce au CCF2-AM, substrat fluorescent de la bêta-lactamase. Les cellules promyélocytaires HL-60 sont résistantes à l'injection des toxines par le SST3 de P. aeruginosa. A l'état différencié en cellules myéloïdes matures, elles sont sensibles à l'injection des toxines. Cette lignée offre donc un modèle cellulaire pertinent. Une approche globale fera intervenir l'interférence ARN sur les cellules sensibles et la transfection des cellules résistantes avec une banque soustractive d'ADNc afin de cloner les protéines impliquées dans l'induction du SST3 et son interaction avec la cellule hôte. Le système rapporteur fluorescent sera optimisé pour effectuer les analyses à haut débit. En parallèle, les profils d'expression des gènes et des protéines dans les cellules non différenciées et différenciées seront comparés par cDNA microarrays ou analyse protéomique. Un certain nombre de protéines de surface, protéines adhésives pour la plupart, dont l'expression diffère selon l'état différencié ou non des cellules, sont des candidats potentiels dans l'interaction du SST3 avec la membrane plasmique de l'hôte. Leur expression sera inhibée par interférence ARN dans les cellules permissives. A l'inverse, les cellules résistantes seront transfectées avec les ADNc codants ces protéines. On étudiera également la fixation directe des protéines purifées du translocon du SST3 sur des cellules intactes ou sur des préparations de membranes. Les domaines membranaires composés de sphingolipides et de cholesterol, ou enrichis en céramides, sont impliqués dans l'infection par les pathogènes. Les héparanes sulfates à la surface des cellules jouent également un rôle important dans la pathogénicité. Le rôle de ces molécules dans l'induction du SST3 ou son insertion dans la membrane cellulaire seront examinés. L'objectif du projet est d'identifier les composants intervenants dans l'interaction spécifique du SST3 avec la membrane des cellules cibles et impliquées dans l'établissement d'un SST3 fonctionnel et dans l'insertion du translocon dans la membrane de l'hôte. Les publications de niveau international qui résulteront de ce travail permettront une meilleure compréhension de l'interaction SST3-hôte et des mécanismes de défense de l'hôte. Le système fluorescent rapporteur de la translocation des toxines pourrait aisément être transposé à d'autres systèmes de sécrétion bactériens. L'adaptation de ce système fluorescent pour effectuer des analyses à haut débit pourra être brevetée avec l'aide du département de valorisation du CEA Grenoble. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pourrait conduire au développement de thérapies innovantes et avoir à moyen ou long terme des retombées sociales et économiques.