Les leptospires : de la génétique à la pathogénèse – LEPTOVIR

La leptospirose, une infection bactérienne transmise par les animaux (principalement les rats), est un problème de santé public majeur dans de nombreux pays en voie de développement. On dénombre plus de 500 000 cas sévères de leptospirose par an avec un taux de mortalité supérieur à 10%.
Les mécanismes moléculaires de la pathogénèse restent largement inconnus. Le principal objectif de ce projet est de générer des mutants chez les leptospires pathogènes par mutagénèse ciblée et aléatoire puis de déterminer si ces mutants sont atténués dans leur virulence dans les modèles animaux. L'inactivation de gène combinée avec l'analyse fonctionnelle des protéines codées par ces gènes devraient nous apporter de précieuses informations sur les mécanismes de survie et de persistence des leptospires dans l'hôte et l'environnement. Ces résultats contribueront à élaborer de nouvelles stratégies pour le diagnostic et la prévention de cette maladie négligée émergente.
Un siècle après la découverte de l'agent causal de la leptospirose (1907, A.M. Stimson), cette zoonose reste un problème de santé public majeur dans les pays en voie de développement. Jusqu'à maintenant, les difficultés rencontrées pour la manipulation génétique des leptospires (notamment la mutagénèse ciblée) ont empêché l'identification de gènes de virulence.
Récemment, nous avons développé des outils génétiques chez le pathogène Leptospira interrogans. Ces avancées, comme celles du séquençage de génomes et la technique de microarray, peuvent maintenant permettre l'utilisation de la génétique pour l'identification des facteurs de virulence et de candidats vaccins chez les pathogènes.
Ce projet a pour principal objectif l'utilisation des outils génétiques développés à l'Institut Pasteur tel que le système de mutagénèse aléatoire par transposition pour déterminer si les gènes inactivés sélectionnés sont des facteurs de virulence chez le cobaye, modèle experimental de la leptospirose. Nous utiliserons aussi le modèle de colonisation persistante du rat développé par nos collègues brésiliens (Fondation Fiocruz, Salvador, Brésil). La perte de la virulence sera évaluée en comparant les résultats de léthalité et de PCR quantitative obtenus chez les animaux infectés par la souche sauvage et les souches mutantes. La construction de leptospires exprimant la GFP (ou mCherry) devrait aussi permettre l'observation de la bactérie dans le modèle animal durant le processus infectieux.
Les facteurs de virulence putatifs seront plus amplement étudiés par cristallisation des protéines, expression hétérologue dans le saprophyte L. biflexa et adhésion du mutant dans un modèle cellulaire. La régulation de ces facteurs de virulence sera étudiée par RT-PCR et/ou l'utilisation de gènes rapporteurs. Enfin, nous évaluerons le rôle immunoprotecteur des meilleurs candidats vaccins chez le cobaye. Les protéines recombinantes seront aussi évaluées pour leur utilité pour le diagnostic sérologique Ce projet est essentiel pour améliorer notre compréhension de la biologie des spirochètes qui reste en grande partie inexplorée. L'analyse génomique des spirochètes a montré que la majorité des gènes de ce phylum codent des protéines de fonction inconnue. L'étude de ces organismes devrait aboutir à la découverte de nouveaux gènes et de nouvelles fonctions. La détermination de la structure protéique sera particulièrement utile pour l'analyse fonctionnelle des protéines sans rôle biologique défini. Les résultats attendus sont la caractérisation de facteurs de virulence, remplissant les postulats moléculaires de Koch, chez les leptospires et l'identification de cibles susceptibles de servir comme candidats vaccins ou pour le sérodiagnostic. L'inactivation de gène combinée avec l'analyse fonctionnelle des protéines codées par ces gènes d'interêt devraient nous apporter de précieuses informations sur les mécanismes de survie et de persistence des leptospires dans l'hôte et l'environnement.