Histones variantes et mémoire épigénétique chez l'homme – EPIVAR

La chromatine joue des rôles clefs dans le contrôle épigénétique de l'activité du génome, particulièrement lors de la détermination de l'identité cellulaire au cours du développement et pour la stabilité de l'état différentié. Des dysfonctionnements de la mémoire épigénétique impliquant la chromatine et la méthylation de l'ADN sont couramment observés dans les cellules cancéreuses et il est généralement admis que qu'ils contribuent au phénotype cancéreux. Parmi les multiples mécanismes de mémoire épigénétique, le remplacement localisé de nucléosomes constitués d'histones canoniques par des nucléosomes portant des histones variantes est susceptible d'affecter considérablement l'activité des régions correspondantes du génome. En effet, les nucléosomes portant des histones variantes adoptent des structures particulières et montrent des variations de propriétés. De plus, certains de ces nucléosomes variants ne sont pas distribués de façon homogène dans le génome. Pour déterminer la fonction de ces histones variantes et pour comprendre leur contribution à l'expression génétique dans les conditions normales ou pathologiques, nous proposons d'attaquer le problème à de multiples niveaux. 1) Nous déterminerons la localisation génomique des sites d'incorporation des histones variantes dans le génome humain en utilisant une combinaison d'approches relativement économiques utilisant des puces à oligonucléotides permettant l'analyse de régions génomiques spécifiques (régions ENCODE, promoteurs, ilôts CpG) et d'approches à haute précision couvrant l'intégralité du génome et reposant sur le séquençage massivement parallèle. 2) Nous identifierons les composants des machineries de dépôt dans la chromatine des histones variantes en utilisant des histones étiquetées pour permettre leur purification suivie d'une identification des protéines associées par spectrométrie de masse. Les complexes de déposition identifiés seront ensuite inactivés par des approches ARNi et les nouveaux complexes susceptibles de les remplacer seront eux aussi identifiés avec la même stratégie. L'impact de ces inactivations sur la distribution génomique des histones variantes sera analysé. 3) Nous analyserons l'impact de modifications post-transcriptionnelles de ces variantes, particulièrement l'acétylation, en utilisant une combinaison d'approches de localisation génomique et de suivi par microscopie de la dynamique de cette modification en utilisant des techniques originales d'imagerie d'interaction protéine-protéine développées au sein du réseau. 4) Nous étudierons la déposition de ces variantes à différentes phases du cycle cellulaire ainsi que la persistance de ces marques épigénétiques à travers réplication et mitose. Ces études seront réalisées surtout dans des cellules en culture, mais certaines des équipes du réseau mettent aussi en route des programmes d'étiquetage des gènes codant pour ces variantes chez la souris qui permettront à terme de réaliser ces analyses globales dans des tissus normaux. L'aspect le plus caractéristique de ce projet et l'ampleur des études qui seront réalisées à l'échelle du génome entier. Nous considérons qu'il est nécessaire d'effectuer ces analyses à cette échelle globale afin d'avoir une compréhension pertinente de la fonction de ces histones variantes dans le contrôle épigénétique de l'activité du génome. Ce projet devrait permettre de réaliser des avancées stratégiques dans la compréhension fondamentale de mécanismes qui ont de l'importance en santé humaine, mais aussi devrait permettre la formation d'une nouvelle catégorie de biologistes qui sont capables d'intégrer des données à très grande échelle dans le cadre de projets focalisés sur des questions biologiques précises. Les approches méthodologiques utilisées sont soit parfaitement maîtrisées, soit on fait l'abjet d'expériences préliminaires qui montrent la faisabilité du projet proposé.