– mRNases

Ce projet est le résultat d'un effort conjoint des équipes de A.J. Carpousis (Toulouse) et de Marc Dreyfus (Paris). La RNase E, identifiée à l'origine chez la bactérie Gram négative Escherichia coli, est le prototype d'une grande famille d'enzymes nommés à présent endoribonucléases de type RNase E/G. La RNase E est nécessaire à la dégradation des ARN messager et à la maturation des ARN stables; c'est un enzyme essentiel. La différence majeure entre les RNase G et RNase E est que cette dernière comporte une région non-catalytique servant de matrice à l'assemblage d'un complexe multi-enzymatique, le dégradosome d'ARN. Outre la RNase E, ce complexe comporte une hélicase à ARN de type DEAD-box et la polynucléotide phosphorylase (PNPase). Les données expérimentales accumulées au cours de cette dernière décennie, ont permis d'établir que ces enzymes en tant que composants du dégradosome coopèrent au processus de maturation et de dégradation des ARN. Des travaux non publiés de l'équipe de A.J. Carpousis ont montré que la RNase E se lie directement à la membrane cytoplasmique d'E.coli via une hélice alpha amphipatique localisée dans la région non-catalytique de l'endoribonucléase. C'est la première preuve d'une association directe entre la RNase E et la membrane, ceci via une interaction entre protéine et bicouche lipidique. La microscopie à fluorescence de cellules exprimant une fusion RNase E-YFP a révélé que des variants de la RNase E altérés dans l'hélice amphipatique forment des foci distincts aux pôles des cellules en croissance. La formation de ces foci est corrélée avec une inhibition marquée de la croissance, ce qui suggére un défaut de dégradation des ARNm ou/et de maturation des ARN stables. Le premier objectif de ce projet est d'explorer le rôle de la localisation de la RNase E à la membrane cytoplasmique interne dans la structure et la fonction de RNase E et du dégradosome. Des travaux précédents issus d'une collaboration entre les équipes Carpousis et Dreyfus ont conduit à proposer que la RNase E a une fonction de surveillance des ARNm dans laquelle les messagers dépourvus de ribosome sont dégradés par un processus nécessitant la région non-catalytique de la RNase E. Cependant ce processus reste mal défini. L'équipe de M. Dreyfus a des résultats non-publiés suggérant qu'il implique la protéine Hfq et peut-être l'intervention d'ARN antisens. Dans ce sens, le complexe Hfq et RNase E pourrait être l'équivalent fonctionnel du complexe eucaryote RISC qui dirigent les activités de dégradation des ARNm par les miARN et siARN. Le second objectif de ce projet est de tester ce modèle. Bacillus subtilis et d'autres bactéries Gram positive ne possèdent pas d'authentiques homologues de RNase E/G. Chez B. subtilis, une nouvelle ribonucléase, la RNase J, a été identifiée et caractérisée comme l'enzyme ayant une spécificité de type RNase E. Cependant, en plus de son activité endoribonucléolytique, la RNase J s'est avérée récemment posséder une activité 5'-3' exoribonucléasique. Ceci est la première description d'une telle activité en dehors du règne eucaryote. Des travaux concernant l'identification et la caractérisation des homologues de la RNase J chez les archaea sont en cours dans l'équipe de AJ Carpousis dans un projet impliquant Béatrice Clouet-d'Orval, chargé de recherche. Comme les bactéries Gram positives, les archaea ne présentent pas d'authentiques homologues de RNase E/G même si une activité de ce type avait été précédemment décrite. Des résultats non-publiés de l'équipe de Carpousis, montrent que les homologues de la RNase J d'archaea hyperthermophiles ont une activité exoribonucléasique. Jusqu'à présent aucune activité endoribonucléasique n'est détectée. Le troisième objectif de ce projet est de caractériser en détail les caractéristiques biochimiques des homologues de la RNase J d'archaea hyperthermophiles.