– Golden Gate

De nombreux mécanismes cellulaires, comme la morphogenèse des cellules, l'établissement de la polarité ou bien la motilité cellulaire, font intervenir un remodelage profond du cytosquelette (Pollard and Borisy 2003). Pour cela, les cellules changent de forme en exerçant des forces internes générées par l'assemblage dynamique de protéines du cytosquelette. Dans notre projet, nous allons examiner en détail l'assemblage et la dynamique d'un des ces polymères du cytosquelette qui est à l'origine de la génération des forces, l'actine. L'actine est un polymère biologique qui peut simultanément s'assembler et se désassembler spontanément ou sous le contrôle d'autres facteurs. On peut observer des réarrangements complexes et dynamiques du cytosquelette d'actine in vivo ou dans des extraits cellulaires. Toutefois, les réactions individuelles responsables de ces réarrangements sont difficilement accessibles dans ces systèmes complexes. Donc, il existe un réel besoin de disposer de systèmes contrôlés biochimiquement où la dynamique de l'actine puisse être reconstituée en présence de ses partenaires afin de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de la production de forces. Idéalement, nous voudrions mesurer simultanément pour chacune des réactions qui dépendent de l'actine comment les paramètres cinétiques de chaque réaction changent en fonction de l'activité de chacun des composants du système. Notre projet se fonde sur des résultats existants. Tout d'abord, nous avons pu observer la dynamique de filaments d'actine isolés dans des systèmes reconstitués avec un ensemble minimal de protéines (Michelot, Berro et al. 2007) (Lab. Blanchoin). Ensuite, nous avons observé le déplacement, à l'échelle macroscopique, d'objets mus par la dynamique de l'actine en utilisant des billes fonctionnalisées et des protéines purifiées (Bernheim-Groswasser, Wiesner et al. 2002) (Lab. Sykes). Ces résultats prouvent que le mouvement qui dépend de l'actine peut être reconstitué et analysé à partir de systèmes très simplifiés par rapport à une cellule vivante. Toutefois, nous voudrions répondre à la question suivante : Est-ce que ces expériences conduites à partir de systèmes reconstitués reproduisent de façon pertinente les événements cytoplasmiques ? En fait, bien que certains aspects de la dynamique de l'actine puissent être reproduits dans ces systèmes utilisant des protéines purifiées, l'ensemble des réactions qui contrôlent la dynamique de l'actine in vivo est extrêmement complexe, impliquant un grand nombre de partenaires. Pour répondre à la question posée, nous proposons d'étudier en parallèle la dynamique de filaments d'actine isolés et le mouvement d'objets propulsés par la polymérisation de l'actine à la fois dans les systèmes de protéines purifiées et dans des extraits acellulaires. Nous complexifierons peu à peu les expériences avec les protéines purifiées en ajoutant un à un différents facteurs associés à l'actine. Avec cette approche ascendante (bottom-up), nous devrions déterminer les facteurs nécessaires à la dynamique de l'actine dans le cytoplasme. Nous voulons aussi reprogrammer des cellules pour préparer des extraits modifiés afin d'observer la dynamique de filaments seuls dans des conditions où leur renouvellement se fait à l'équilibre chimique. Cette approche descendante (top-down) nous permettra de construire des ponts entre les différents comportements des filaments d'actine dans un contexte cellulaire, d'une part, et des systèmes très simplifiés capables de reproduire la dynamique de l'actine in vitro, d'autre part. L'assemblage dynamique de l'actine a lieu principalement à la membrane. Donc, les expériences en solution où les facteurs associés à l'actine peuvent diffuser librement, ne sont pas suffisantes pour comprendre le mécanisme de la génération de forces et du mouvement. C'est pourquoi nous placerons les activateurs de l'actine à la surface de membranes artificielles afin d'observer la déformation des membranes sous l'