– GPC3-POST-TRANS

Dans les eucaryotes supérieurs, l'expression de nombreux gènes est contrôlée au niveau post-transcriptionnel par l'élément «AU riche» (ARE), une séquence située dans la région 3'non traduite (R3'NT) de certains ARNm. L'ARE inhibe l'expression d'un gène en induisant la dégradation et en réprimant la traduction de l'ARNm correspondant. La fonction de l'ARE est sous le contrôle de nombreux facteurs trans-régulateurs, les ARE-binding proteins (ARE-BPs). Alors que la fixation de la grande majorité des ARE-BPs sur l'ARE active sa fonction inhibitrice, celle d'HuR, une protéine nucléaire navette, l'empêche avec comme conséquence l'augmentation de la stabilité et de la traduction de l'ARNm et l'élévation d'expression du gène correspondant. Finalement, de petits ARNs non codants, les miARNs, interviennent dans le contrôle post-transcriptionnel de l'expression des gènes gouverné par l'ARE. L'altération fonctionnelle d'un ARE peut avoir une incidence en cancérologie humaine via l'élévation d'expression de certains gènes. Cette altération peut provenir d'une modification de la nature protéique du complexe associé à l'ARE qui fait suite à l'expression ou à la localisation subcellulaire anormale d'une ARE-BP, comme cela a été montré pour HuR. Elle peut provenir également de la réduction d'expression d'un miARN ciblant l'ARNm du gène surexprimé. Dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) (un cancer primitif du foie), de nombreux gènes ayant un rôle en carcinogenèse hépatique et qui contiennent un ARE potentiel dans leur ARNm, sont surexprimés. Cependant aucune étude n'a été réalisée à ce jour afin de déterminer si l'expression anormale de ces gènes dans le CHC est liée au dysfonctionnement de l'ARE contenu dans leur ARNm. Le but de notre projet est d'étudier in vivo et de façon comparative la fonctionnalité d'AREs modèles dans les hépatocytes humains primaires et des cellules de lignée de CHC. Pour cela, nous avons développé un système rapporteur EGFP simple, basé sur la transduction lentivirale, la cytométrie en flux et la PCR quantitative, qui nous a permis d'évaluer in vivo le niveau de fonctionnement d'AREs provenant de gènes surexprimés dans le CHC. Nos résultats préliminaires montrent que pour au moins deux gènes (c-myc et Glypican-3 (GPC3)), la capacité de l'ARE à inhiber l'expression du gène rapporteur EGFP pourrait être altérée dans les cellules tumorales de CHC par rapport aux hépatocytes normaux. Dans le cas du GPC3, c'est la première fois qu'une telle régulation post-transcriptionnelle est décrite. C'est une des raisons pour laquelle nous avons choisi d'utiliser la R3'NT du GPC3 comme modèle d'étude. Des résultats complémentaires ont montré que (i) HuR et TIA-1, deux ARE-BPs à effet inhibiteur potentiel sur la fonction de l'ARE, se fixent sur la R3'NT du GPC3 in vitro, (ii) Ces deux protéines sont fortement exprimées dans les cellules tumorales, (iii) TIA-1 est anormalement retrouvé dans les noyaux des cellules tumorales, (iv) HuR est anormalement retrouvée dans le cytoplasme des cellules tumorales. - Les principaux objectifs de ce projet sont les suivants : - 1- Localiser la ou les séquences cis régulatrices présentes dans la R3'NT du GPC3. - 2- Identifier les protéines trans-régulatrices (autres que HuR et TIA-1) capables de se fixer sur la R3'NT du GPC3. - 3- Déterminer si la R3'NT du GPC3 contrôle l'expression de l'EGFP via la stabilité de l'ARNm. - 4- Etudier le rôle de HuR, TIA-1 et des autres facteurs potentiels dans le fonctionnement de la R3'NT du GPC3 et la surexpression du GPC3 dans le CHC. - 5- Déterminer si la localisation cytoplasmique de HuR et celle nucléaire de TIA-1 joue un rôle dans le contrôle positif exercé par la R3'NT du GPC3 sur l'expression de l'EGFP dans les cellules tumorales. - 6- Evaluer la relevance physiopathologique de la surexpression de TIA-1 et HuR dans la carcinogenèse hépatique. - 7- Déterminer si certains miARNs jouent un rôle dans la régulation post-transcriptionnelle du gène du GPC3 et sa surexpressi...