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Les hydrogénases sont des enzymes qui catalysent la conversion biologique entre dihydrogène et protons, une réaction particulièrement importante tant sur le plan biologique que chimique. Ces enzymes peuvent en effet être utilisées comme catalyseurs soit à l'anode de biopiles à combustible, soit pour faire produire de l'hydrogène à partir d'eau et d'énergie lumineuse par des microorganismes photosynthétiques. Les hydrogénases sont des enzymes de grande taille et particulièrement complexes. Les étapes chimiques du cycle catalytique ont lieu au site actif, constitué d'un agrégat organo-métallique. Ce site actif profondément enfoui à l'intérieur de la protéine est connecté au solvant par des canaux hydrophobes qui permettent la diffusion intramoléculaire de petites molécules (H2, inhibiteurs), par un chapelet de cofacteurs rédox pour le transfert d'électrons, et par des acides aminés qui assurent l'échange de protons. - - On classe les hydrogénases en deux familles principales selon la nature des métaux présents au site actif. Notre projet concerne les hydrogénases à fer qui possèdent la plus grande activité pour l'oxydation de H2. Bien que ces enzymes fassent l'objet d'une compétition intense sur le plan international, leur étude s'est longtemps heurtée à des difficultés liées à leur fragilité et au fait qu'elles sont produites par des microorganismes qui ne permettent pas la mise en Suvre des techniques d'ingénierie génétique. - Nos expériences préliminaires ont permis de lever les principaux obstacles relatifs à l'ingénierie, la production et l'étude détaillée d'une hydrogénase à fer. Cela nous a conduit à bâtir un groupe interdisciplinaire qui réunit pour la première fois trois équipes dont les expertises dans les domaines de la biochimie, la biologie moléculaire, la chimie physique et la modélisation se complètent parfaitement. Pour certains aspects plus spécifiques du projet, nous ferons appel à d'autres équipes qui nous ont assurés de leur collaboration. - - Nous utiliserons toutes les possibilités offertes par les techniques de mutagenèse dirigée et les techniques physiques pour étudier le mécanisme de cette hydrogénase, en insistant tout particulièrement sur les déterminants structuraux de la réactivité, de la sensibilité aux inhibiteurs (parmi lesquels O2), et du biais catalytique (oxydation vs production de H2). Cette étude nous apportera des informations extrêmement précieuses dans la quête de ce qui constitue le Graal des recherches sur les hydrogénases: une enzyme très activite mais tolérant le dioxygène. - - Nous avons sélectionné l'hydrogénase à fer de la bactérie Clostridium acetobutilicum comme système modèle pour les raisons suivantes. (1) L'Equipe 2 vient de réussir à développer les procédures qui permettent d'élaborer, de modifier sélectivement et de purifier cette enzyme. Il s'agit d'une première mondiale dans ce domaine. (2) On connaît actuellement les structures moléculaires de deux enzymes de cette classe et l'une d'elles a été déterminée par l'Equipe 3, dont l'expertise permettra d'identifier facilement les cibles de mutagénèse dirigée. (3) Des études préliminaires viennent d'être effectuées sur cette enzyme par l'Equipe 1 en utilisant l'électrochimie directe, une technique cinétique qui est très appropriée à l'étude du mécanisme des hydrogenases. Nos résultats montrent que l'enzyme est extrêmement active mais beaucoup moins sensible à l'O2 (au moins aux courtes échelles de temps) que ce que l'on pensait. Ces résultats contredisent la croyance générale selon laquelle une grande réactivité vis-à-vis du substrat naturel va de pair avec une grande sensibilité à l'O2. Ils suggèrent aussi qu'il devrait être possible d'identifier ou d'élaborer une hydrogénase qui possède une grande activité en présence de O2. - - Notre but est d'étudier le mécanisme catalytique des hydrogénases à fer pour comprendre comment les propriétés globales de l'enzyme sont déterminées à l'échelle moléculaire. Tous les facteurs potentiels s...