– DEINOCOCCUS

Deinococcus radiodurans et Deinococcus deserti (une bactérie isolée récemment à partir de sable prélevé au Sahara) appartiennent à une famille de bactéries caractérisées par leur capacité exceptionnelle à résister aux agents qui endommagent l'ADN, en particulier les radiations ionisantes ou ultraviolettes et la dessiccation. La radiorésistance de ces bactéries est liée à leur capacité de reconstruire un génome intact à partir de centaines de fragments engendrés par les radiations ionisantes, alors que le génome de la plupart des organismes est irrémédiablement détruit dans les mêmes conditions. Les gènes « de réparation » trouvés habituellement chez les bactéries ont été identifiés dans leur génome, mais les mécanismes moléculaires responsables de leur radiorésistance ne sont toujours pas complètement élucidés. Des mécanismes actifs (réparation de l'ADN) et passifs (structure du nucléoïde) pourraient agir de concert pour assurer leur survie à des stress variés. Différents mécanismes de réparation ont été proposés pour assurer la reconstruction d'un génome intact à partir d'un génome fragmenté : appariement simple-brin dépendant d'une synthèse active d'ADN (ESDSA), recombinaison homologue (HR) et recollement des extrémités (NHEJ). La structure très compacte du nucléoïde des bactéries radiorésistantes pourrait jouer un rôle important dans ces processus en évitant la dispersion des fragments d'ADN et en maintenant les extrémités des fragments à proximité les unes des autres. Le nucléoïde de D. radiodurans présente une structure toroïdale qui demeure inchangée après exposition à de fortes doses de radiations alors que le nucléoïde très condensé de D. deserti n'adopte pas une structure « figée », suggérant que la condensation, plutôt que la structure précise du nucléoïde, pourrait jouer un rôle important chez les bactéries radiorésistantes. - Différentes stratégies sont envisagées pour mieux comprendre le rôle des mécanismes actifs et passifs dans la résistance de Deinococcus aux agents qui endommagent l'ADN. - (1) Une comparaison détaillée des génomes et des protéomes de D. radiodurans et D. deserti est en cours et pourra servir de base pour sélectionner à priori de nouvelles protéines candidates impliquées dans les mécanismes de radiorésistance. - (2) Nous construirons différentes souches tests pour évaluer in vivo la contribution respective des mécanismes tels que ESDSA, HR, NHEJ dans la réparation des cassures double-brins de l'ADN. En particulier, nous adapterons à D. radiodurans une stratégie développée chez Saccaromyces cerevisiae en introduisant un site unique de coupure par l'endonuclease HO dans un gène dispensable et nous évaluerons la réparation de cette cassure et sa fidélité dans différents contextes génétiques. Nous établirons, à partir de ces analyses génétiques, l'implication de diverses protéines candidates dans les différents mécanismes de réparation. - (3) Les activités des protéines peuvent dépendre de leur appartenance à des complexes multi-protéiques ou d'interactions transitoires avec différents partenaires. Pour mettre en évidence les réseaux protéiques impliqués dans la radiorésistance, nous purifierons des complexes protéiques formés in vivo en utilisant la méthode du SPA-tag. Les protéines présentes dans les complexes seront identifiées par spectrométrie de masse et leur rôle dans la réparation de l'ADN sera déterminé. - (4) Nous caractériserons les mécanismes impliqués dans la compaction du nucléoïde des Deinococcaceae et nous déterminerons leur rôle dans la radiorésistance. Nous isolerons les protéines associées aux nucléoïdes de D. radiodurans et de D. deserti et nous les caractériserons en utilisant des approches génétiques et des approches biochimiques. - ...