Caractérisation de canaux calciques propres aux lymphocytes Th2. Application au traitement de maladies allergiques. – CALYTE

En collaboration avec le groupe 2, nous avons montré que les lymphocytes T (LT)h2 qui peuvent être responsables des manisfestations allergiques expriment des récepteurs à la dihydropyridine (DHP), impliqués dans l'influx calcique suite à l'activation via le récepteur T pour l'antigène (TCR). Or la voie calcique est nécessaire à la production des cytokines (IL-4, IL-5 et IL-13) délétères dans l'asthme, ce qui explique très probablement nos résultats montrant que des antagonistes de ces récepteurs préviennent efficacement l'inflammation pulmonaire dans des modèles d'asthme allergique. En collaboration avec le groupe 2, nous avons montré dans les LTh2 la présence d'amplicons codant les sous-unités alpha1 des canaux dépendant du voltage Cav1.2 et Cav1.3, normalement caractéristiques des cellules excitables. Le projet CALYTE vise à élucider la structure et le mode de fonctionnement de ces canaux dans les LTh2. L'enjeu de ce travail est d'étudier si les LTh2 expriment la forme classique de ces canaux et d'établir un modèle rendant compte de leur fonctionnement dans ces cellules non excitables. De plus, il a récemment été montré que la partie carboxyterminale du canal Cav1.2 (CCAT) se comportait comme un facteur de transcription. Nous étudierons donc le rôle éventuel de CCAT dans le contrôle de l'expression génique des LTh2. 1) Après séquençage complet des canaux Cav1.2 et Cav1.3, nous clonerons les cDNA "taggés", construirons le retrovirus codant ces unités pour transduire les LT. 2) Nous développons avec le groupe 2 une technique d'imagerie (patch optique) permettant de visualiser des influx calciques très localisés (microscopie en onde évanescence) et les logiciels permettant de déterminer les caractéristiques biophysiques des canaux. Nous comparerons des LTh2 et des LTh2 transfectés avec des oligonucléotides anti-sens/siRNA. L'efficacité de la transfection sera évaluée sur la baisse d'expression des canaux, sans influence majeure sur celle des autres acteurs de la signalisation calcique. 3) L'utilisation de LTh2 transduits avec les canaux Cav1 "taggés" nous permettra de suivre la localisation des canaux (membrane versus reticulum, recrutement à la synapse immunologique). La sur-expression de ces canaux nous permettra de déterminer en collaboration avec le groupe 3 si ces canaux exprimés dans des LT ou des ovocytes de Xénope se comportent comme des canaux sensibles à la dépolarisation. 4) L'existence de CCAT comme facteur de transcription éventuel dans les LTh2 et les variations de sa localisation nucléaire selon l'état d'activation du LT sera évaluée par microscopie confocale et western blot à l'aide d'un anticorps qui sera généré. 5) La cinétique d'expression des canaux Cav1 dans les LT au cours de la différenciation en LTh2 suggère qu'elle est postérieure à celle du facteur de transcription spécifique des LTh2 GATA-3. Nous approcherons l'éventuel rôle de GATA-3 dans l'induction de ces canaux en transduisant GATA-3 par un retrovirus dans des LT naïfs et en testant l'induction des canaux par RT-PCR quantitative en temps réel. 6) Nous testerons la capacité d'oligonucleotides antisens spécifiques des canaux Cav à inhiber la réaction inflammatoire dans des modèles d'asthme allergique dont nous disposons au laboratoire. 7) Nous prévoyons de tester l'expression préférentielle de canaux Cav1/ récepteurs aux DHP sur les LT présents dans le liquide de lavage alvéolaire de patients asthmatiques. Ce travail pourrait nous permettre de valider certains aspects de notre hypothèse reposant sur le fait que les LTh2 expriment peu de canaux Cav1 mais que ceux-ci peuvent se regrouper et augmenter leur probabilité d'interagir avec des kinases comme les PKC lors de la stimulation via le TCR Cette étude pourrait contribuer à montrer les différences dans les voies de signalisation utilisées par des populations de LT exerçant des fonctions différentes, avec des répercussions possibles sur le développement de traitements plus ciblés de pathologies immunes comme l'asthme allergique. D'autre part, cela pourrait permettre d'élargir la compréhension d'un mode de fonctionnement des canaux Cav1, indépendamment de modifications de potentiel de membrane, un sujet qui est toujours un haut sujet de polémique.